引用本文
徐志成, 刘炜彬, 陈新星, 童奇. DNA IQTM SYSTEM在疑难指甲DNA检验中的应用 [J]. 刑事技术,2015,38(4): 28-29
XU Zhi-cheng, LIU Wei-bin, CHEN Xin-xing, et al. Application of the DNA IQTM SYSTEM in extraction of DNA from nail samples [J]. Forensic Science and Technology,2015,38(4): 28-29  
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DNA IQTM SYSTEM在疑难指甲DNA检验中的应用
徐志成1, 刘炜彬1, 陈新星1, 童奇2
1.浙江省湖州市公安局刑侦支队,313000
2.浙江省安吉县公安局刑侦大队,313300

作者简介:徐志成(1977—),男,汉族,浙江常山人,主检法医师,医学士学位,主要从事法医DNA检验和研究。Tel:0572-2252197; E-mail:xu_chichung@163.com

摘要

目的探索DNA IQTM SYSTEM在疑难指甲DNA提取中的应用。方法15份疑难指甲采用Chelex方法检验没有成功获得STR分型图谱,采用DNA IQTM SYSTEM提取法并纯化,采用Identifiler PLUS试剂盒进行复合扩增,产物经ABI3130XL型DNA基因分析仪检测。结果成功获得15例疑难指甲的STR基因座DNA分型。结论DNA IQTM SYSTEM方法能快速、有效提取疑难指甲DNA进行STR分型。

关键词: Chelex; 指甲; DNA IQTM SYSTEM; DNA提取
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2013)04-0028-02
Application of the DNA IQTM SYSTEM in extraction of DNA from nail samples
XU Zhi-cheng, LIU Wei-bin, CHEN Xin-xing, et al
Public Security Bureau of Huzhou City, Zhejiang 313000, China
Abstract

Objective To investigate the application of the DNA IQTM SYSTEM in extraction of DNA from nail samples.Methods The genomic DNA from 15 difficult nail samples was extracted by the DNA IQTM SYSTEM and the PCR was performed using the identifiler®Plus kit in the GeneAmp PCR system 9700. The PCR products were separated by capillary electrophoresis in ABI PRISM 3130xL genetic analyzer.Results the STR profiles from the 15 samples were successfully obtained.Conclusion The DNA IQTM SYSTEM is a fast and efficient system for the extraction of the DNA from difficult nail samples.

Keyword: chelex; nail; DNA IQTM SYSTEM; the extraction of DNA

指甲是现场常见的生物物证, 在高度腐败尸体中指甲DNA检验是较理想的检材[1], 但常规方法检验指甲DNA存在着检验流程过长, 成功率低的情况。笔者对近年所受理的共126份指甲进行了检验, 其中15份疑难指甲采用Chelex方法没有获得STR分型图谱或者仅获得了部分STR分型图谱, 而采用DNA IQTM SYSTEM提取法均成功获得了STR分型, 而且缩短了提取时间, 介绍如下。

1 材料与方法
1.1 样 本

本实验室日常检案所积累的15份采用Chelex方法检验没有获得STR分型图谱或者仅获得了部分STR分型图谱的疑难指甲样本, 其中包括土中掩埋6个月以上3例、河水中浸泡超过1个月以上10例、污水中浸泡2个月2例, 均为高度腐败尸体上提取。

1.2 仪器及试剂

3130XL型基因分析仪(ABI公司); 金座9700型PCR扩增仪(ABI公司); 5355型恒温混匀仪(eppendorf)。DNA IQTM SYSTEM(Promega公司); Identifiler PLUS剂盒(ABI公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 DNA提取 剪取指甲中段约0.5cm× 0.5cm大小, 放入1.5mL离心管中, 直接加入300μ L含DTT的裂解缓冲液(lysis buffer), 加15μ L 蛋白酶K(20mg/mL), 56℃保温4h~6h, 95℃保温30min, 然后离心吸取上清液, 加入7μ L 充分混匀的磁珠(IQ Resin), 高速振荡使磁珠悬浮后室温保温5min, 高速振荡2s后离心2s, 将离心管放在磁力架上, 小心吸去溶液(注意不要触碰磁珠), 加入100uL含DTT的裂解缓冲液洗涤一次(方法同上), 用洗涤缓冲液(wash buffer)洗涤3次(方法同上), 打开盖子, 室温下空气干燥5min~10min, 加入洗脱缓冲液(Elution buffer)100μ L, 高速振荡2s使磁珠完全悬浮, 立即放于65℃保温5min, 立即振荡2s后离心2s, 趁热将离心管放于磁力架上, 取液体到新管, 得到纯化的DNA溶液可直接用于扩增反应。

1.3.2 PCR扩增与扩增产物的检测 提取的DNA模板采用Identifiler PLUS试剂盒进行STR复合扩增, 产物采用ABI-3130XL型DNA基因分析仪电泳分离和激光扫描分析, 得到检验鉴定结果。

2 结果与讨论

Chelex方法没有检验成功的15份疑难检材, 采用DNA IQTMsystem法提取15例指甲均成功获得了全部基因座STR分型(见图1)。

图1 采用DNA IQTM SYSTEM提取法提取后的得到的STR分型图谱

DNA IQTM SYSTEM是Promega公司专为法医物证、亲子鉴定所设计的DNA定量提取、纯化系统。其独特的DNA IQ顺磁性树脂可有效去除PCR抑制物成分(包括蛋白质、各种离子等)及案例实验分析过程中常见的污染物, 而且这些磁性颗粒捕获DNA后不会结团, 很容易就可以把其中的裂解液用洗涤液洗掉, 对于DNA含量大的样品, 在提取的同时, 可以提供恒定的DNA样品量, 即7uL磁珠可以得到大约100ng的DNA, 这使后续的PCR扩增和检测变得更容易。

指甲属于角化组织, 由多层连接牢固的表皮角化细胞构成, 细胞内充满角蛋白丝, 富含二硫键, 结构致密, 不易被消化。Chelex方法提取往往需要12h以上, 采用二步消化法[2]、分阶段消化法[3], 需要更长时间; 但是过长的消化时间会导致大片段位点的降解[4], 经检测得到的图谱可能会出现小片段峰值高, 大片段峰值低, 甚至大片段不出现的情况, 但是DNA IQTMsystem法, 由于利用裂解液加蛋白酶K进行消化裂解, 指甲的消化裂解速度明显加快, 一般2h左右指甲呈透明状, 而且非常柔软, 4~6h指甲基本消化完全, 因此后续检验容易得到比较好的STR分型图谱。

图1污水浸泡尸体指甲采用Chelex方法、二步消化法分阶段消化并纯化等方法提取后得到的STR分型图谱。

水中浸泡较长时间的指甲采用DNA IQTMsystem法第一次并没有检出完整STR分型图谱, 笔者将指甲在通风柜中通风干燥1天, 待其完全干燥后采用DNA IQTMsystem法提取, 成功检出STR分型图谱。指甲被水浸泡一段时间后往往呈现乳白色, 与指甲本来的颜色有明显差别。分析认为指甲被水浸泡一段时间后水分子进入到指甲中, 充满在角化细胞周围, 甚至部分进入到角化细胞中, 导致裂解液被水分子阻断难以进入到指甲中发挥裂解作用, 只能分布在指甲表面, 因此指甲难以在短时间内被消化裂解, 故检验未成功。而待指甲干燥后, 裂解液不会受到水的影响, 就能顺利进行消化裂解, 并检验成功。因此当遇到被水浸泡至发白的指甲, 建议在检验前先将指甲进行干燥, 待其恢复颜色再开始后续提取检验。

在检验过程中, 笔者遇到一例指甲(指甲体较厚)经裂解液加蛋白酶K进行消化裂解后, 裂解液呈粘稠状, 难以进行上清液的吸取, 如遇这种情况可通过追加300 uL裂解液稀释, 震荡混匀, 达到容易吸取上清, 继续进行STR分型检验。

在另一例高度腐败尸体的指甲检验时, 笔者直接采用95℃保温30min, 立即吸取上清采用DNA IQTMsystem法提取纯化, 顺利获得了指甲的DNA, 提取DNA所用的时间仅用了1h, 较常规方法检验时间大为缩短。

综上所述, DNA IQTMsystem法能快速、有效的提取疑难指甲DNA。对于高度腐败的尸体, 指甲是较为理想的DNA检材。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 王祥, 王海生, 葛台明, 等. 五年土埋尸体指甲检出DNA认定尸源1例[J]. 刑事技术, 2007(2): 26. [本文引用:1]
[2] 胡慧英, 刘超. 用二步消化法提取指甲[J]. 中国法医学杂志, 2004, 19(6): 361. [本文引用:1]
[3] 孙耀东, 李健. 1例土埋2年半尸体的指甲DNA检验[J]. 法律与医学杂志, 2006, 13(1): 55-56. [本文引用:1]
[4] 刘开会, 郭燕霞, 沈燕莎, 等. 指甲的DNA提取及STR分型[J]. 中国法医学杂志, 2003, 18(2): 109-113. [本文引用:1]