引用本文
何光龙, 孙溢, 赵艳. 弥漫性轴索损伤实验装置的研制及应用[J]. 刑事技术,2015,38(4): 25-27
HE Guang-long, SUN Yi, ZHAO Yan. Designation and application of the DAI experimental facility[J]. Forensic Science and Technology,2015,38(4): 25-27  
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《刑事技术》编辑部
弥漫性轴索损伤实验装置的研制及应用
何光龙1, 孙溢2, 赵艳3
1.公安部物证鉴定中心,北京 100038
2.福建福州市公安局刑侦支队,350000
3.山东烟台市经济技术开放区公安分局,261042

作者简介:何光龙(1978—),男,福建人,主检法医师,硕士,主要从事法医病理、损伤的检案及科研工作。Tel:010-66269471; E-mail:guanglong_he@163.com

基金: 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金计划项目(No.2007JB009)
摘要

目的自行研制弥漫性轴索损伤的致伤装置,并利用该装置成功复制动物模型。方法采用自行设计的瞬时旋转加-减速致伤装置,使家兔头部在冠状位逆时针加速旋转90°,后瞬间减速运动停止,并于伤后6h、12h、24h 3个时相点处死,取材、石蜡包埋,行HE染色、镀银染色及β-APP免疫组化染色,以观测神经轴索的损伤特征。结果致伤后家兔行为和脑组织病理学特征均符合弥漫性轴索损伤表现,大脑中线结构附近(脑皮质下、胼胝体及内囊)出现点灶状出血和斑片状β-APP阳性着色等神经轴索的损伤。结论瞬时旋转加-减速致伤装置可以成功复制弥漫性轴索损伤动物模型,具有操作简单、重复性强的特点,且通过更换不同规格的扭矩弹簧可适用于其他中小型动物。

关键词: 弥漫性轴索损伤; 旋转致伤装置; 模型复制; 家兔; 法医学
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2013)04-0025-03
Designation and application of the DAI experimental facility
HE Guang-long, SUN Yi, ZHAO Yan
Institute of Forensic Sciences,Ministry of Public Security, Beijing 100038, China
Abstract

Objective To design the DAI experimental facility and establish DAI animal models.Methods With the transiently rotation accelerative and decelerate vulnerate facility designed by author, the heads of rabbits were anticlockwise revolved to 90° and stop fleetly. The rabbits were killed at 6h, 12h, 24h after injury, respectively. HE staining, silver staining and β-APP immunohistochemistry were done and then the changes of axon were observed.Results After injury, the rabbits,behavior and pathology feature accorded with appearance of DAI. These animals had punctiform hemorrhage and patching positive reaction of β-APP at cortex-alba junction, corpus callosum and internal capsule.Conclusion The vulnerate facility can successfully duplicate the DAI, and the models are easily operated and have a large applicability.

Keyword: diffuse axonal injury(DAI); vulnerate facility; model replication; rabbit

弥漫性轴索损伤(Diffuse axonal injury, DAI)是指头部遭受钝性外力作用后引起的以脑白质神经轴索弥漫性损伤为主要特征的一种脑损伤, 好发于交通事故、坠落、打击等, 尤其多见于交通事故。因其临床上死亡率较高, 在法医检案中较为多见, 而临床及组织病理学无特征性表现, 使得早期诊断方法研究成为法医学鉴定难、热点问题。多年来国内外法医病理学家一直致力于其生物力学机制、病理机制及诊断方法等方面研究。成功复制动物模型是开展相关研究的前提条件和必备条件。既往常用的模型有横断损伤模型[1]、打击负荷伤模型[2]、液压损伤模型[3]、牵拉损伤模型[4]、瞬时旋转损伤模型[5, 6]及加速/减速损伤模型[7], 其中前4种模型虽能复制出弥漫性轴索损伤, 但亦造成其他类型的严重颅脑损伤。目前, 对DAI生物力学机制的认识国内外基本趋于一致, 即外力使颅脑产生加减速运动, 脑组织内部遭受剪切力作用所致。从致伤机制上, 后两种模型较为符合也比较常用, 但亦存在模型复制的不稳定性。本研究依据DAI生物力学机制, 融合了加速/减速损伤模型和瞬时旋转损伤模型的优点, 自行研制出瞬时旋转加-减速致伤模型, 并通过伤后动物行为和病理学特征, 评价模型复制的可靠性和稳定性。

1 材料与方法
1.1 旋转致伤装置研制

1.1.1 装置原理 剪切力是DAI形成最为重要的力学基础, 易发生于头部成角和(或)旋转加(减)速过程。本装置利用扭矩弹簧的驱动使头部在冠状位旋转90° , 从而获得较大角加速, 后通过限位杆的碰撞使头部在瞬间获得巨大的反方向角减速度。其中瞬间反方向旋转减速运动, 使脑组织产生巨大的惯性负荷, 从而使神经轴索受到剪切、牵拉作用, 这是模型复制的关键点也是创新点。

1.1.2 装置构成 本装置整体总重51kg, 由适形头箍、带U形头夹的旋转盘、前后档板、底座、扭矩弹簧、T形插条、限位杆及配套工具箱组成(见图1)。

图1 旋转致伤装置图

(1)固定部分:主要包括U 形整体头夹及适形头箍, U 形头夹直接刚性连接于转动盘, 转动盘与轴承紧密连接, 头夹两侧用螺栓旋紧固定适形头箍, 并可根据实验动物头颅大小, 适时调整U形头夹上螺栓的位置。(2)动力驱动部分:该装置的动力主要由扭矩弹簧提供, 弹簧扭转释放后可带动轴承、旋转盘, 从而带动实验动物头部作同步旋转加速运动。本装置可使动物头颅在冠状位作0° ~180° 旋转, 且可通过更换扭矩弹簧的规格获得不同的角加速度。弹簧规格可根据实际需求设计, 有ϕ 5mm(12箍、9箍、6箍)、ϕ 6mm、ϕ 7mm、ϕ 8mm等。(3)回旋装置:轴承后挡板内的旋转盘上每隔15° 钻有固定孔, 通过扳手将固定有驱动弹簧的轴承顺时针方向, 旋转到预定角度(0° 到180° 之间可实现每间隔15° 旋转), 后用T形插条插入对应固定孔定位、固定。(4)释放装置:垂直拔出T形插条, 弹簧释放动力, 使头颅逆时针旋转加速, 最后以钟摆式振荡后迅速停止, 模拟旋转加-减速运动。(5)限位装置:带U形头夹的旋转盘上挖有弧形槽, 将前挡板上条形限位杆插入槽内, 通过限位杆与槽壁碰撞, 可产0° ~90° 范围内角加速后的瞬间反方向减速运动。

1.1.3 装置使用 将满意麻醉的兔子固定于动物台上, 并将适形头箍安置于兔头后, 把头箍放置U形头夹中央, 两侧用螺栓旋紧、固定头箍(见图1)。待动物苏醒后出现挣扎, 在稳定间歇期内拔动T形插条, 兔头瞬间逆时针旋转后停止, 迅速将动物从装置上卸下, 观察伤后行为状态并实时记录。通过更换扭矩弹簧规格、设定旋转角度可控制角加速度大小、瞬间作用时间、旋转角度等。

1.2 动物模型制作

选取健康的雄兔10只, 体重2.33± 0.15kg, 随机分为正常对照组、损伤Ⅰ 组和损伤Ⅱ 组。损伤Ⅰ 组6只, 按伤后存活6h、12h、24h分3个时相点, 每个时相点各2只; 损伤Ⅱ 组2只, 伤后存活24小时; 对照组2只。实验动物称重后腹腔注射2%戊巴比妥钠溶剂(60mg/kg)后, 将满意麻醉的家兔安置于上述致伤装置, 装置设定条件为ϕ 7mm扭矩弹簧(7箍)、瞬间逆时针旋转90° 。损伤Ⅰ 组动物致伤过程增加限位装置, 撞击后产生瞬间反方向减速运动, 而损伤Ⅱ 组无限位装置, 瞬间逆时针旋转90° 后以钟摆式振荡后迅速停止, 比较两种致伤过程的差异性。致伤后, 观察伤后行为状态, 并于相应时相点处死、取材、病检。对照组除未进行旋转致伤外其余与损伤组同。

1.3 组织处理

实验动物在预设时相点行腹腔麻醉后开胸, 用4%多聚甲醛经心脏灌注固定后, 开颅取脑, 同液冷藏固定7d后, 大脑沿冠状面作4个切面, 脑干、小脑沿矢状中线作2个切面取材, 石蜡包埋, 制作5μ m厚切片备检。

1.4 染色方法

组织切片分别进行HE染色、Gless-Marsland氏改良银浸染色法和β -APP免疫组化染色。免疫组化采用SP法, 一抗为β -APP(Clone 4E12, Code NO.M066-3, MBL, Japan)、稀释度1∶ 400, 二抗为MaxVisionTM试剂盒(福州迈新生物技术公司供), 结果用DAB显色。

2 结 果
2.1 伤后行为观察

损伤Ⅰ 组动物伤后出现不同程度的昏迷伴四肢强直、呼吸深大转浅快, 持续时间在10min~30min, 其中4只动物出现大小便失禁, 清醒后活动能力下降, 对强疼痛刺激反应弱, 无主动觅食行为。损伤Ⅱ 组动物伤后出现短暂昏迷, 持续1min~2min, 早期呼吸节律加快, 后生命体征、活动能力及饮食状况均未见明显异常。正常组动物从装置卸下后无异常改变。

2.2 病理变化

肉眼改变:对照组和损伤Ⅱ 组大脑肉眼未见明显异常。损伤Ⅰ 组脑组织出现不同程度肿胀, 脑回增宽、脑沟变浅, 大脑切面偶见点灶状出血。

HE染色:正常对照组HE染色下未见异常改变。损伤Ⅱ 组见部分神经元及血管周围间隙增宽等轻度水肿改变外, 未见损伤出血。损伤Ⅰ 组在大脑皮质下、胼胝体、第三脑室旁见小灶性出血, 部分出血灶周围见少量反应性星形胶质细胞; 伤后存活24组在胼胝体见少量类圆形、均质粉染小体, 既轴索收缩球(Axonal reaction ball, ARB), 内囊区域亦可见大量ARB聚集呈花簇群样(见图2、图3)。

图2 箭头示类圆形ARB(胼胝体 HE× 400)

图3 箭头示片状ARB聚集(内囊 HE× 400)

银染:正常对照组白质内神经轴索排列整齐。损伤Ⅱ 组局部神经轴索轻度肿胀、部分呈波浪样改变。损伤Ⅰ 组伤后局部神经纤维断裂、肿胀, 或呈波浪样改变, HE染色可见大量ARB的区域内神经轴索灶片状碎裂崩解、缺染(见图4)。

图4 神经纤维大片状缺染(内囊银染× 100)

β -APP染色: 对照组和损伤Ⅱ 组部分神经元胞浆内见少量棕色颗粒沉积外, 白质内未见异常。损伤Ⅰ 组在伤后6小时在大脑皮质下、胼胝体及内囊周围见大量类圆形、梭形及条梭状棕色颗粒物沉积(见图5~图7)。

图5 神经轴索大片状阳性反应(内囊β -APP× 100)

图6 大量轴索收缩球散在分布(皮质下β -APP× 400)

图7 大量轴索收缩球散在分布(胼胝体 β -APP× 100)

3 讨 论

Adams等[8]于1982年提出DAI这一病理学名词, 认为脑内灰质与白质的质量密度不同, 因此它们运动时产生的加速度及惯性也不同, 又由于脑组织的不易屈性, 以致突然的加、减速运动可使灰白质之间产生相对位移, 形成一种剪切样力, 造成脑损伤。

基于上述的生物力学机理, 本研究在前人模型研究的基础上, 创新性地设计出瞬时旋转加-减速致伤装置。通过损伤Ⅰ 组和Ⅱ 组对照性研究发现, 损伤Ⅰ 组的动物在临床表现和病理特征上均成功复制出DAI动物模型, 而损伤Ⅱ 组在临床表现上呈现有轻度脑震荡表现, 但病理特征尚未达到DAI的诊断标准。究其原因主要是损伤Ⅰ 组动物致伤过程中增设了限位装置, 使兔脑在冠状位瞬间旋转90° 过程中, 脑组织各部位获得较大加速度, 后限位杆撞击致脑组织各部位瞬间获得巨大的反方向减加速度。恰恰是因为瞬时反方向减速运动, 使得脑组织各部位获得巨大惯性负荷, 脑内灰白质相互位移, 产生剪切力致神经轴索及小血管破裂损伤。损伤Ⅱ 组动物致伤过程与Gennarelli及贺晓生等人[5, 6]的模型基本一致, 兔脑在冠状位瞬间旋转90° , 后以钟摆式振荡停止, 虽然也经历了反向减速过程, 但瞬时作用时间延长, 反向减加速度降低, 不易造成神经轴索和小血管的损伤。因此, 在相同旋转角度和角加速度的情况下, 瞬时作用时间的长短是模型复制成功与否的关键点。而本研究增设的限位装置, 可大大缩短瞬时作用时间, 使模型复制更加稳定、可靠。同时本装置可通过调整U形头夹的宽度和更换不同规格的扭矩弹簧, 适用于鼠、兔、猫、猴等大、中、小型动物的模型建立, 因此具有使用范围广、操作简单、重复性好等特点, 值得推广应用。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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