国产法医DNA检验试剂耗材检测DNA标准品的准确性研究
孙敬1, 赵兴春1, 叶健1, 胡兰1, 李万水1, 李瑞云2, 季安全1, 刘冰1, 孙辉1, 庞晓东2, 张涛2
1.公安部物证鉴定中心,北京 100038
2.公安部第一研究所,北京 100048

作者简介:孙敬(1980—),男,汉族,天津人,博士,主检法医师,主要从事法医分子遗传学研究。Tel:010-63434093; E-mail:jackiesunjing@163.com

摘要

目的利用法医DNA标准品对自主研发的法医DNA检验试剂耗材进行电泳检测准确性的实验考查。方法实验平台分为2个:平台1全部由美国Applied Biosystems公司进口的3130xl遗传分析仪、16道电泳毛细管与甲酰胺、电泳缓冲液、凝胶构成;平台2由Applied Biosystems公司进口的3130xl遗传分析仪、16道电泳毛细管与本实验室研发的甲酰胺、电泳缓冲液、凝胶构成。在实验平台上对allelic ladder、内标等标准品以及阳性对照9947a的STR复合扩增产物进行电泳检测,利用GeneMapper软件对电泳结果进行分析。结果自主研发的法医DNA检验试剂耗材可与国外进口的3130xl遗传分析仪配套使用,构建的实验平台对法医DNA标准品的检测结果准确无误。结论自主研发的甲酰胺、电泳缓冲液、凝胶等法医DNA检验试剂耗材检测准确性达到了国外同类产品水平。

关键词: 甲酰胺; 电泳缓冲液; 凝胶; 准确性; 法医DNA标准品
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2013)02-0025-03
The accuracy study of reagents for DNA electrophoresis using forensic DNA standard sample
SUN Jing, ZHAO Xing-chun, YE Jian, et al
Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security, Beijing 100038, China
Abstract

Objective To study the accuracy of reagents for DNA electrophoresis using forensic DNA standard samples. Methods Two experiment platforms were involved in the detection systems, one was made up of 3130xl genetic analyzer, capillary array and the reagents for DNA electrophoresis including formamide, buffer and polymer from Applied Biosystems Inc. the other was made up of 3130xl genetic analyzer, capillary array from Applied Biosystems Inc. and the reagents developed by our own. Forensic DNA standard samples such as allelic ladder, internal standard DNA and the PCR products of positive control 9947a were detected on the experiment platforms. The results were analyzed by GeneMapper software.Results The formamide, buffer and polymer developed by our own can be compatible with 3130xl genetic analyzer. The detection results of forensic DNA standard samples were accurate. Conclusion The reagents for DNA electrophoresis developed by our own are of the same accuracy level as the similar foreign products.

Keyword: formamide; buffer; polymer; accuracy; forensic DNA standard samples

在日常法医DNA检验分析中, 检测平台一般由测序仪和配套耗材两大部分组成。测序仪主要为各种型号的遗传分析仪, 而法医DNA检验耗材主要包括电泳毛细管以及甲酰胺、电泳缓冲液、凝胶等试剂消耗品。其中甲酰胺的主要作用是作为变性剂抑制DNA分子二级结构的形成[1, 2]。凝胶则作为DNA的支持物和分离介质, 起到类似分子筛的作用, 决定了DNA的迁移率和分辨率, DNA片段在凝胶中可按分子大小逐一分离[3, 4, 5]。缓冲液在电泳过程中的主要作用是维持合适的pH值, 电泳时正极与负极都会发生电解反应, 正极发生的是氧化反应, 负极发生的是还原反应, 长时间的电泳将使正极变酸, 负极变碱, 缓冲液具有较强的缓冲能力, 使溶液两极的pH值基本保持不变[6]。缓冲液的另一个作用是使溶液具有一定的导电性, 以利于DNA分子的迁移[7]。总之, 上述试剂消耗品是硬件仪器平台维持正常运转以及软件分析平台实现正确分型的基础。

目前, 在我国开展的各项法医DNA检验工作中, 检测平台一般都依赖进口。针对这一问题, 本实验室在“ 十一五” 二期国家科技支撑计划项目资金的资助下, 研发出了甲酰胺、电泳缓冲液、凝胶等试剂消耗品, 有效的弥补了国内在该领域的研究空白。鉴于试剂消耗品在法医DNA检验中的重要作用, 本研究将研究成果与目前国内各地DNA实验室广泛应用的3130xl遗传分析仪组成实验平台, 在实验平台上利用法医DNA标准品研究了试剂耗材的检测准确性能, 并与国外同类试剂耗材进行平行对比, 为试剂消耗品进一步应用到实际案件检验以及DNA数据库建设工作提供实验基础和参考依据。

1 材料和方法
1.1 研究对象

研究对象为甲酰胺、电泳缓冲液、凝胶等法医DNA检验试剂耗材样品, 均为公安部物证鉴定中心承担的国家“ 十一五” 科技支撑计划课题“ 法医DNA专用检测平台系列消耗品及标准物质关键技术研究” 的研究成果。

1.2 仪器与试剂

生物安全柜(Heal Force公司); 台式离心机(贺利氏公司); 9700型热循环仪、3130xl遗传分析仪、电泳毛细管(Applied Biosystems公司); 超纯水仪(Millpore公司)。

DNATyperTM15试剂盒(公安部物证鉴定中心); IdentifilerTM试剂盒、进口的甲酰胺、电泳缓冲液、凝胶(Applied Biosystems公司); 阳性对照9947a样品由DNATyperTM15试剂盒提供。

1.3 方 法

1.3.1 检测平台的构建 本研究的检测平台包括2个:平台1全部由美国Applied Biosystems公司进口的3130xl遗传分析仪、16道电泳毛细管与甲酰胺、电泳缓冲液、凝胶构成; 平台2由Applied Biosystems公司进口的3130xl遗传分析仪、16道电泳毛细管与公安部物证鉴定中心研发的甲酰胺、电泳缓冲液、凝胶构成。

1.3.2 实验方法 按照3130xl遗传分析仪操作手册在构建的实验平台上进行空间校准和光谱校准检测, 创建DNATyperTM15、IdentifilerTM试剂盒的光谱校准文件。

按照DNATyperTM15试剂盒说明书在实验平台1和平台2上检测allelic ladder和内标, 并对试剂盒提供的阳性对照9947a进行复合扩增, 在实验平台上电泳检测扩增产物, 利用GeneMapper ID v3.2软件分析全部电泳结果。

2 结果与讨论
2.1 空间校准检测

利用3130xl遗传分析仪控制软件中的空间校准操作进行空间校准, 结果显示在检测平台上成功进行了空间校准(见图1)。

图1 空间校准图谱

2.2 光谱校准检测

利用试剂盒提供的荧光标准物在检测平台上进行光谱校准。DNATyperTM15光谱校准结果如图2所示:每道毛细管光谱图谱中峰的顺序从左至右为蓝-绿-黄-红, 顺序正确, 光谱中的峰不含大范围交迭、倾斜等不规则现象; 原始数据图谱中从左至右峰的顺序为红-黄-绿-蓝, 顺序正确; 16道毛细管的Q值均大于0.95。IdentifilerTM光谱校准结果如图3所示:每道毛细管光谱图谱中峰的顺序从左至右为蓝-绿-黄-红-橙, 顺序正确, 光谱中的峰不含大范围交迭、倾斜等不规则现象; 原始数据图谱中从左至右峰的顺序为橙-红-黄-绿-蓝, 顺序正确; 16道毛细管的Q值均大于0.95。结果表明在检测平台上分别成功创建了DNATyperTM15和IdentifilerTM各自相应的光谱校准文件。

图2 DNATyperTM15光谱图谱

图3 IdentifilerTM光谱图谱

2.3 标准样品的检测

DNATyperTM15试剂盒allelic ladder和内标Typer500的电泳分析结果分别如图4A图4B(平台1)和图5A图5B(平台2)所示:在检测平台2上检测得到的 allelic ladder在全部15个STR基因座位上分型准确、没有出现等位基因丢失现象; Typer500片段大小准确、完整, 无片段丢失, 与检测平台1得到的检测结果一致。

图4A 平台1的allelic ladder电泳结果

图4B 平台1的Typer500电泳结果

图5A 平台2的allelic ladder电泳结果

图5B 平台2的Typer500电泳结果

2.4 阳性对照的STR分型准确性检测

利用GeneMapper软件分析9947a的电泳结果, 9947a的STR分型如图6A(平台1)和图6B(平台2)所示:检测平台2得到的9947a分型图谱完整, STR基因座等位基因分型准确, 没有发生等位基因丢失、扩增不均衡等现象, 与检测平台1得到的结果一致。

图6A 平台1的9947a STR分型图谱

图6B 平台2的9947a STR分型图谱

3 讨 论

本实验室自主研发的法医DNA检验试剂耗材可与国外进口的3130xl遗传分析仪配套使用, 构建的实验平台对法医DNA标准品的检测结果准确无误, 检测准确性达到了国外同类产品水平。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Sarkar G, Kapelner S, Sommer SS. Formamide can dramatically improve the specifity of PCR[J]. Nucleic Acids Research, 1990, 18(24): 7465. [本文引用:1]
[2] Biega L A, Duceman B W. Substitution of H2O for formamide in the sample preparation protocol. for STR analysis using the capillary electrophoresis system: the effects on precision, resolution, and capillary life[J]. Journal of Forensic Sciences, 1999, 44(5): 1029-1031. [本文引用:1]
[3] Albarghouthi MN, Barron AE. Polymeric matrices for DNA sequencing by capillary electrophoresis[J]. Electrophoresis, 2000, 21(18): 4096-4111. [本文引用:1]
[4] Albarghouthi MN, Buchholz BA, Doherty EA, et al. Impact of polymer hydrophobicity on the properties and performance of DNA sequencing matrices for capillary electrophoresis[J]. Electrophoresis, 2001, 22(4): 737-747. [本文引用:1]
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[7] Slater GW, Kenward M, M c Cormick LC, et al. The theory of DNA separation by capillary electrophoresis[J]. Curr Opin Biotechnol, 2003, 14(1): 58-64. [本文引用:1]