引用本文
吴海, 晏晓军, 高汨, 尹坚英, 徐连生. HPLC-MS/MS同时检测全血中佐匹克隆、唑吡坦和扎来普隆[J]. 刑事技术,2013,38(2): 22-24
WU Hai, YAN Xiao-jun, GAO Mi, et al. Simultaneously determination of zopiclone, zolpidem and zaleplon in whole blood samples by HPLC-MS/MS[J]. Forensic Science and Technology,2013,38(2): 22-24  
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《刑事技术》编辑部
HPLC-MS/MS同时检测全血中佐匹克隆、唑吡坦和扎来普隆
吴海, 晏晓军, 高汨, 尹坚英, 徐连生
湖南省公安厅物证鉴定中心,长沙 410001
高汨。Tel:0731-84590937; E-mail:2046gm@163.com

作者简介:吴海(1984—),男,浙江人,硕士,助理工程师,主要从事毒物检验鉴定研究。

基金: 公安部应用创新计划项目[No.2005YYCXHNST092]
摘要

目的建立全血中佐匹克隆、唑吡坦和扎来普隆的液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱联用同时检测方法。方法采用液液萃取进行提取,提取物以Zorbax Eclipse Plus C18(2.1×50mm,1.8μm)色谱柱分离,以10mmol/L甲酸铵(含0.1%甲酸)-乙腈为流动相梯度洗脱,流速为0.2mL/min,四级杆-飞行时间串联质谱检测。结果全血中佐匹克隆和扎来普隆的线性范围为10ng/mL~500ng/mL,检出限为3ng/mL;唑吡坦的线性范围为3 ng/mL~300 ng/mL,检出限为1ng/mL。结论本方法准确、快速、灵敏,可用于全血中佐匹克隆、唑吡坦和扎来普隆的同时定性、定量检测。

关键词: 佐匹克隆; 唑吡坦; 扎来普隆; 四级杆-飞行时间串联质谱
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2013)02-0022-03
Simultaneously determination of zopiclone, zolpidem and zaleplon in whole blood samples by HPLC-MS/MS
WU Hai, YAN Xiao-jun, GAO Mi, et al
Institute of Forensic Science, Public Security Department of Hunan Province, Changsha 410001, China
Abstract

Objective To establish a HPLC-QTOF MS/MS method for simultaneously determination of zopiclone, zolpidem and zaleplon in whole blood samples.Methods Samples were extracted by liquid-liquid extraction. The extracts were analyzed with a Zorbax Eclipse Plus C18(2.1×50mm,1.8μm)column and gradient elution by mobile phase consisted of 10mmol/L ammonium formate(contain 0.1% formic acid )-acetonitrile at 0.2mL/min, quadrupole-time of flight tandem MS detector was used.Results The calibration curves were linear over 10ng/mL~500ng/mL for zopiclone and zaleplon, 3ng/mL~300ng/mL for zolpidem. The limit of detection was 3ng/mL for zopiclone and zaleplon, 1ng/mL for zolpidem.Conclusion The method is simple, accurate, sensitive and convenient for simultaneously qualitative and quantitative determination of zopiclone, zolpidem and zaleplon in whole blood samples.

Keyword: zopiclone; zolpidem; zaleplon; Q-TOF MS/MS

佐匹克隆、唑吡坦和扎来普隆是20世纪80年代后期开发的新一代非苯二氮卓类催眠药。由于此类药物口服吸收良好, 见效快、安全性较高, 目前使用广泛且易获得。近年来, 利用该类药物实施麻醉抢劫、强奸及凶杀的刑事案件或者误服或口服该类药物自杀的事件时有发生[1, 2, 3]。快速准确检测出该类药物对于公安机关在侦查办案过程中确定案(事)件性质、分析作案手段、提供诉讼证据等方面具有重要意义, 为临床针对性治疗此类患者也可提供重要的参考作用。

目前该类药物的检验方法主要有气相色谱法[4]、液相色谱法[5]、气质联用法[6]、液质联用法[7]等。本研究以家兔为模型动物, 采用家兔灌胃给药、液-液萃取、HPLC-MS/MS同时检测全血中佐匹克隆、唑吡坦和扎来普隆, 报道如下。

1 仪器与材料
1.1 仪 器

Agilent 1200-6520 Q-TOF LC-MS/MS系统(美国Agilent公司); Milli-Q纯水系统(美国Millipore公司); 氮气吹干仪(北京八方公司); H1850R型高速离心机(湖南湘仪公司)。

1.2 材 料

佐匹克隆、唑吡坦、扎来普隆标准品购自中国药品生物制品检定所; 乙腈(色谱纯, Fisher公司); 甲酸(LCMS级, Sigma公司); 流动相用水为超纯水; 其它试剂为分析纯试剂。

普通级家兔4只, 体重1.5~2kg/只(购自中南大学湘雅医学院实验动物部)。采用家兔作模型动物, 根据预实验中家兔对各个药物反应的差异分别确定灌服剂量, 其中佐匹克隆使用量为250mg/kg, 唑吡坦和扎来普隆使用量均为100mg/kg, 于橄榄油中涡旋混匀, 通过一次性灌胃给药。家兔禁食12h, 随机选取一只家兔作为空白对照, 其余3只家兔一次性灌胃给药, 经过1个半衰期后抽取血液进行检测。

2 方 法
2.1 标准溶液的配制

分别准确称取佐匹克隆、唑吡坦、扎来普隆标准品配制成1.0mg/mL的乙腈储备液, 置于4℃冰箱中保存, 使用时用流动相稀释成所需浓度。

2.2 检材溶液的制备

准确量取检材1mL, 加入2mL乙醚, 涡旋振荡提取1min, 8000r/min离心10min, 以移液器移取1mL上清液, 氮吹仪挥干, 1mL乙腈-水(1∶ 1, V/V)溶解并涡旋混合, 过0.22μ m滤膜, 待测。

2.3 分析条件

色谱条件:色谱柱 Zorbax Eclipse Plus C18(2.1× 50mm, 1.8μ m), 柱温35℃; 进样量5μ L; 流动相10mmol/L甲酸铵缓冲液(含0.1%甲酸)-乙腈梯度洗脱, 洗脱梯度程序见表1; 流速0.2mL/min。

表1 洗脱梯度

质谱条件:采用电喷雾离子源(ESI), 分析物在正离子扫描模式下检测。Fragmentor电压125V; 毛细管电压3000V; 干燥器温度350℃; 干燥气流速10L/min; 喷雾压力35psi; 检测范围100-1500m/z; 双喷雾模式, 使用参比溶液实时校正质量轴; 4GHz高精度模式记录质谱数据。单TOF模式进行筛选。Q-TOF串联质谱模式进行二次确证, 母离子和CID碰撞能见表2, 优化参数后的二级质谱图见图1。

表2 Q-TOF串联质谱条件
图1 佐匹克隆、唑吡坦和扎来普隆标样的Q-TOF MS/MS谱图
3 结 果
3.1 选择性实验与结果

本文先后考察了流动相中有机相甲醇、乙腈和甲醇-乙腈组合, 水相中添加0.1%甲酸、10mmol/L甲酸铵-甲酸、10mmol/L乙酸铵-乙酸、10mmol/L甲酸铵-氨水构成缓冲液的影响; 比较了在Zorbax Eclipse Plus C18、Zorbax Eclipse Plus C8、Zorbax Extend-C18等色谱柱上的色谱分离行为。综合分离度、峰形、稳定性、使用范围、灵敏度等各种因素, 选定了Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱在10mmol/L甲酸铵(0.1%甲酸)-乙腈做为流动相梯度洗脱下对3个待测药物进行分离, 分离结果见图2。

图2 全血中3个待测物的提取离子色谱图

3.2 精密度、准确性和基质效应实验与结果

采用国际上通行的Matuszewski提出的方法[8]考察其准确性、精密度和基质效应。按2.3中步骤提取后进行检测。基质效应和整体回收率结果见表3。

表3 精密度、准确性和基质效应实验结果(n=5)
3.3 线性范围和检出限实验与结果

在选定的色谱和质谱条件下, 对一系列浓度的混合标准品溶液进行分析。以峰面积进行定量, 得佐匹克隆的线性方程为y=3374.1x-8531.2, R2=0.9991, 线性范围是10ng/mL~500ng/mL, 检出限为3ng/mL。唑吡坦线性方程为y=50833x-37554, R2=0.9999, 线性范围是3ng/mL~300ng/mL, 检出限为1ng/mL。扎来普隆的线性方程为y=8799.3x-23347, R2=0.9997, 线性范围是10ng/mL~500ng/mL, 检出限为3ng/mL。

3.4 模拟动物实验结果

家兔空白对照未检出佐匹克隆、唑吡坦和扎来普隆, 灌药家兔血液中均检出佐匹克隆、唑吡坦和扎来普隆, 浓度分别为4.19μ g/mL(RSD=7.16%), 0.29μ g/mL(RSD=8.11%), 0.49μ g/mL(RSD=6.56%)。

4 讨 论

(1)本文优化的分离条件下, 3个待测物分离度好, 灵敏度高, 具有良好的回收率与精密度, 基质效应较小, 适用于佐匹克隆、唑吡坦和扎来普隆中毒、麻醉抢劫、强奸等案(事)件中全血样品检验。

(2)高分辨质谱定性筛选目标物速度快准确性高。利用工作站从高分辨质谱数据中自动筛选出可能的化合物, 结合精确分子量数据库检索匹配, 可以快速锁定待测目标物。3个待测物的检索结果见图3和表4所示。TOF质谱的高分辨特性, 获得的待测物m/z非常精确, 与理论值的偏差非常小(均≤ 2ppm), 同时结合理论同位素的峰形和丰度数据进行综合匹配(Abund Match和Spacing Match), 更进一步确定检索结果。有时更可结合微弱的[M+Na]+和[M+K]+的高分辨质谱数据再次增加定性准确性。为了更加准确的确定目标物, 对筛选出目标峰可获取高分辨率的Q-TOF二级质谱信息进行进一步确证(见图1)。

图3 佐匹克隆、唑吡坦和扎来普隆的一级TOF质谱图及检索结果

表4 3个待测物准分子离子峰([M+H]+)的检索结果

本方法利用飞行时间质谱的高分辨率特性, 一次检测就可以进行准确的无标样筛选。并可根据实际情况, 获取筛选目标峰的高分辨二级碎片质谱图进行确证。该方法通用性强, 在建立起包含精确分子量等物质信息的数据库基础上, 不仅对本文所列3种待测物, 对其它第三代镇静催眠药以及第一代、第二代镇静催眠药等其他常见药物也可达到同时筛选的目的。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Meatheall RC. Zopiclone fatality in a hospitalized patient[J]. J Forensic Sci, 1997, 42(2): 340-343. [本文引用:1]
[2] 刘磊峰. 佐匹克隆临床应用50例分析[J]. 中国民康医学, 2006, 18(6): 425. [本文引用:1]
[3] 孟瑞, 卢敏. 佐匹克隆中毒32例的救治体会[J]. 泰山医学院学报, 2010, 31(11): 874-875. [本文引用:1]
[4] D Debruyne, J Lacotte, B Hurault de ligny, et al. Determination of zolpidem and zopiclone in serum by capillary column gas chromatography[J]. J Pharm Sci, 1991, 80(1): 71-74. [本文引用:1]
[5] 杨丽君, Rochholz Gertrud. 反相高效液相色谱法测定血清中的佐匹克隆[J]. 色谱, 2002, 20(3): 256-258. [本文引用:1]
[6] 王占良, 张建丽, 张亦农. 气相色谱-质谱联用法检测保健品中8 种安眠镇静类药物[J]. 质谱学报, 2009, 30(5): 282-286. [本文引用:1]
[7] 刘苍松, 于忠山, 董颖. HPLC-MS/MS法测定人血中唑吡坦成分[J]. 刑事技术, 2008(3): 9-11. [本文引用:1]
[8] BK Matuszewski, ML Constanser, CM Chaves-Eng. Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC-MS/MS[J]. Anal Chem, 2003(75): 3019-3030. [本文引用:1]