引用本文
于蔚常. 肝中杀鼠酮硅藻土提取高效液相色谱检测法研究[J]. 刑事技术,2012,37(6): 45-46
YU Wei-chang. Determination of Valone in liver[J]. Forensic Science and Technology,2012,37(6): 45-46  
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肝中杀鼠酮硅藻土提取高效液相色谱检测法研究
于蔚常
辽宁省丹东市刑侦支队,118000

作者简介:于蔚常(1973—) ,女,辽宁省丹东市人,理学学士,工程师,主要从事毒品和毒物方面检验研究。Tel:13942570700

摘要

目的 建立肝中杀鼠酮的硅藻土提取方法和高效液相色谱检测法。方法 取0.5g肝匀浆,加6% HClO4沉淀蛋白,准确取1/2上清液倒入装有3.1g硅藻土的层析柱中,用10mL二氯甲烷或乙醚洗脱,洗脱液中加入安定作为内标,水浴浓缩,用0.2mL甲醇定容,供高效液相色谱分析。结果 提取率分别为98.1%和99.9%,检出限分别为14ng/mL和13ng/mL。结论 该方法简便、快速、提取率高,可作为法医毒物常规检测手段。

关键词: 杀鼠酮; 肝; 高效液相色谱法; 硅藻土
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2012)06-0045-02
Determination of Valone in liver
YU Wei-chang
Dandong Public Security Bureaus, Dandong 11800, China
Abstract

Objective To establish a method for determining Valone in liver.Methods Valone in liver was extracted in diatomite column with codichloromethane and ether respectively, and then the extraction was analyzed by high performance liquid chromatography.Results The extraction rate were 98.1% and 99.9%, the limits of detection were 14ng/mL and 13ng/mL.Conclusion The method is simple, rapid, high extraction rate and can be used as a conventional method of forensic toxicology.

Keyword: Valone; high performance liquid chromatography; diatomite

杀鼠酮是目前国内外广泛应用的茚满二酮类抗凝血杀鼠剂, 误服、投毒等原因引起的人畜中毒案件时有发生, 是司法鉴定中常见毒物之一。目前, 国内对杀鼠酮的研究甚少, 已报道肝中检测方法主要为亲脂性材料(GDX)固相萃取紫外导数光谱检测法[1], 国外已报道肝中检测方法主要为液液提取高效液相色谱检测法[2, 3]。

液液提取的提取率较低, 杂质多, 亲脂性材料(GDX)固相萃取操作繁琐、费时。亲水性材料(硅藻土)提取是新发展起来的一种固相提取方法, 属液液分配原理, 该法操作极为简单、快速, 提取率高, 去除杂质能力强, 但目前该法应用于肝中杀鼠酮的提取尚未见报道。就检测方法而言, 杀鼠酮不易气化, 气相色谱法不适合其检验; 紫外光谱法抗干扰能力差、一般定性能力差只适合定量; 高效液相色谱法较适合其检测。因此本文建立了硅藻土提取高效液相色谱检测法, 报道如下。

1 实验部分
1.1 试剂与材料

肝脏购至市场新鲜猪肝, 匀浆后冰箱冷冻保存。

杀鼠酮纯品(公安部二所购买), 质量符合国家药检规定。临用时用甲醇配成1.0mg/mL标准储备液冰箱中保存。

安定用甲醇配成1.0mg/mL标准储备液冰箱中保存。

二氯甲烷、乙醚、甲醇、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、冰醋酸、醋酸钠、四丁基氢氧化胺、磷酸等均为分析纯试剂。

6% HClO4:6mL HClO4加水至100mL。

pH9缓冲液:8.4g碳酸氢钠溶于100mL水中, 10.6g碳酸钠溶于100mL水中, 将碳酸钠溶液逐渐倒入碳酸氢钠溶液中, 用精密试纸调至pH为9。

实验用水为二次蒸馏水。

1.2 提取方法

取检肝0.5g加2.0mL 6% HClO4涡旋、振荡, 倾出上清液, 沉淀中再加1.5mL 6% HClO4涡旋、振荡, 合并上清液, 准确取2mL上清液, 倒入装有3.1g硅藻土的小层析柱中(10mL医用塑料注射器外管, 下端塞少许脱脂棉), 待溶液完全浸入硅藻土后, 用10mL乙醚或二氯甲烷洗脱, 收集洗脱液于尾管中, 加内标安定, 45℃水浴挥干, 用甲醇定容至0.2mL, 供液相色谱分析。

1.3 色谱条件

日立— 7100高效液相色谱仪。L-7420紫外检测器, L-7300柱温箱, D-7000型HPLC管理系统。色谱柱:ODS· C18 5μ m(4.6× 150mm)。柱温:30℃。检测波长:280nm。流动相:甲醇:0.016g/mL四丁基氢氧化胺的水溶液(2:1), 用浓磷酸调至pH6.5(所用试剂在使用前均经过0.45μ m滤膜过滤。流速:1.0ml/min。

2 结果与讨论
2.1 色谱条件考查

杀鼠酮是茚满二酮类抗凝血杀鼠剂, 呈酸性, 在非极性固定相上基本无保留, 所以离子对试剂的选择非常重要。离子对试剂有两类, 阳离子型和阴离子型, 为了使杀鼠酮在C18烷基键合固定相和以甲醇/水为流动相的反相色谱体系中有保留, 必须在流动相中加入与杀鼠酮离子带相反电荷的阳离子型“ 离子对试剂” 或称“ 反离子” , 使其与试剂离子形成中性配合物(“ 离子对” ), 这样才能在非极性的固定相表面有所保留, 所以实验中我们加入了四丁基氢氧化铵。在本实验色谱条件下样品与内标完全分离(见图1、图2)。

图1 2μ g杀鼠酮、5μ g安定标准图谱

图2 0.5g肝添加2μ g杀鼠酮、5μ g安定图谱

2.2 标准曲线

分别取1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、13.0μ g杀鼠酮标准溶液, 均添加内标10.0μ g, 用甲醇定容至0.2mL。以杀鼠酮色谱峰面积与内标峰面积之比为纵坐标(y)、杀鼠酮浓度为横坐标(x, μ g/mL), 进行线性回归, 得到标准曲线:Y=0.103X-0.23, r=0.9992。

2.3 硅藻土用量及上清液用量的考查

根据硅藻土提取原理, 硅藻土用量与上清液量需匹配。若将沉淀蛋白后的全部上清液完全倾入层析柱中, 硅藻土的用量至少为10g, 实验成本高, 且洗脱剂用量也要加大, 挥干用时长, 体现不出此方法的优点。

经对添加杀鼠酮的肝检材进行实验, 以每份上清液的2mL过柱, 提取率经折算(2倍), 只需3.1g硅藻土, 且提取率很高。因此, 实验选择2mL上清液过3.1g硅藻土。

2.4 洗脱溶剂、pH值及提取率的考查

取空白肝0.5g, 加入5.0μ g杀鼠酮标准溶液, 上清液直接过柱或调pH9, 用不同洗脱溶剂, 其余按本文方法进行操作, 结果见表1。由表1数据可见, 上清液直接过柱用乙醚或二氯甲烷作为洗脱溶剂有较高的提取率, 且方法简便。

表1 不同pH条件各洗脱溶剂提取率%考查(n=5)

取空白肝0.5g(n=7), 分别加入5.0μ g杀鼠酮标准溶液, 内标添加量10.0μ g, 按本文方法进行操作。乙醚洗脱平均提取率为99.9%, 变异系数为3.2%; 二氯甲烷洗脱平均提取率为98.1%, 变异系数为3.0%。

2.5 检出限的考查

取空白肝0.5g, 按本文方法进行操作, 内标添加量2.0μ g, 用乙醚洗脱或二氯甲烷洗脱。从所得色谱图计算杀鼠酮色谱峰Rt处基线噪音与内标物色谱峰高的比值。以3倍信噪比计算检出限为13ng/mL和14ng/mL。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 谭家镒, 姜兆林, 吴玉红. 肝中茚满二酮类杀鼠剂固相萃取-紫外导数光谱检测法[J]. 分析化学, 1998, 26(4). [本文引用:1]
[2] Hunter K, Sharp EA. Modification to procedures for the determination of chlorophacinone and for multi-residue analysis of rodenticides in animal tissues[J]. J Chromatogr, 1988, 437: 301-305. [本文引用:1]
[3] Thongchai C, Lawrence JF, Micheal JM. Simultaneous determination of eight anticoagulant rodenticides inblood serum and liver[J]. J Analy Toxicol, 1993, 17(1): 56-61. [本文引用:1]