DNA分析技术检验粪便2例
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吴绪尧, 曾国文, 陈馨扬. DNA分析技术检验粪便2例[J]. 刑事技术,2012,37(4): 55-56
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DNA分析技术检验粪便2例
关键词:
DNA检验; 粪便; 循环数
中图分类号:DF795.2
文献标志码:B
文章编号:1008-3650(2012)04-0055-02
1 案件简介
案例1 某年1月, 某理发店发生一起入室盗窃案, 技术人员将现场一处可疑长条状粪便送检, 冷冻保存。
案例2 某年4月, 某县一民宅发生一起盗窃案, 技术员在该民宅三楼楼梯口发现一粪便, 风干后送检。
2 检 验
案例1 在粪便靠近两端的边缘处分别剪取100mg粪便共计4份(编号J1、J2、J3、J4), 再用棉签沾水后擦拭粪便表面, 获得另外4份样品(编号C1、C2、C3、C4)。将以上样品分别置于1.5mL空离心管中, 加500μ L纯水, 室温浸泡10min后, 13000r/min离心3min。吸掉上清液, 至少重复以上步骤3次。往沉淀物中加入200μ L Buffer G2, 10μ L PK, 56℃金属浴消化12h以上, 13000r/min离心3min, 保留上清液。此后通过DB-80全自动核酸提取仪进行DNA提取。
取上述粪便的DNA 提取液1μ L、3μ L分别作为模板, 其中热循环条件中的循环次数分别采用28、30、34次, 用Identifiler复合扩增系统在10μ L体系中进行扩增。STR分型在3130XL型基因分析仪 (ABI公司)上完成。
粪便DNA经不同条件扩增后, 仅J1~J4, 循环数30、34的16份样品分别扩出4~13个(不含Amelo基因座)不等的基因座。其中, 模板量1μ L, 循环数30的样品分别扩出4~9个, 模板量1μ L, 循环数34的分别扩出6~10个; 模板量3μ L, 循环数30的样品分别扩出5~13个, 模板量3μ L, 循环数34的分别扩出9~13个。
上述结果中部分基因座的扩增结果并不稳定, 为验证数据的可靠性, 作者又选取扩增效果最佳的两个样品J3和J4进行了多次扩增(模板量3μ L, 循环数34), 最终获得了完整的STR基因分型结果, 并导入DNA数据库中。
最终, 该案件与另一起盗窃案成功串并, 为案件的破获提供了有力支持。
案例2 在粪便靠近两端的边缘处剪取100mg粪便2份(编号J1、J2), 按案例1的提取方法进行提取。取DNA提取液3μ L作为模板, 采用30和34个循环数进行扩增。其中编号J1, 循环数34的样本一次性获得完整的基因分型(见图1)。为验证结论的可靠性, 又重复扩增多次, 证实结论无误后录入DNA数据库进行比对。
 | 图1 案例2提取粪便样本DNA的STR分型图谱 |
经比对, 该案件与案发地的另外两起盗窃案成功串并。所获得的STR分型数据成功比对上外市DNA数据库中的一个违法犯罪人员。
3 讨 论
3.1 提取方法的优化
粪便的主要成分是一些未消化的食物残渣, 这些食物残渣在经过肠道时经常会夹杂有大量脱落的肠道上皮细胞一起排出体外。研究表明, 每g人的新鲜粪便中会含有105个肠道细胞, 且大部分是活细胞[1]。这意味着理论上可以从粪便中获取粪便生产者的DNA进行遗传分析。然而, 粪便由于其细菌种类多以及多聚糖、胆酸、胆盐、胆色素等 PCR强抑制物的存在[2], 使DNA不仅易降解, 而且 PCR 扩增也很困难, 因此选择合适的提取方法是粪便DNA成功检测的关键。
由于粪便中的DNA容易因多种降解性酶类的存在而降解, 因此, 实际能从粪便中提取到的DNA要远远低于其理论值。为了提升样品中的DNA含量, 作者采用了擦拭法和边缘剪取法两种方法进行提取, 并作分析比较。其中, 使用擦拭法提取的粪便DNA样本最终未扩出一个基因座(见图2), 而使用边缘剪取法提取的样本均扩出了部分基因座(见图3)。
 | 图2 选取擦拭法获得的STR分型图谱两份 |
 | 图3 选取边缘剪取法获得的STR分型图谱两份 |
粪便表面因为与肠道接触的时间较多, 理论上含有比粪便内部更多的DNA, 但由于粪便DNA的总体含量偏低, 仅提取表面部分的DNA还是很难满足检验要求。据此, 作者建议采用边缘剪取法提取粪便样品, 并进行多点取样, 以提高粪便DNA的检出率。
另外, 由于粪便保存的时间越长, DNA的降解越严重, 因此, 建议案发现场出现这类检材时应及早提取送检。
有实验证明[3], 酚-氯仿法、chelex法等常规方法不适合粪便 DNA 的提取。本实验应用EZ1 DNA Tissue Kit(QIAGEN公司)试剂, 并通过DB-80全自动核酸提取仪进行粪便DNA提取, 在更大限度上去除了粪便DNA中的扩增抑制物, 提升了粪便DNA的检出成功率。
3.2 循环次数的优化
在PCR扩增中, 适当增加循环次数, 使DNA合成更充分, 从而提高灵敏度, 该方法已被许多人用于多种类型低拷贝检材的DNA分析。但循环次数增加过多, 却会产生峰值不平衡或等位基因丢失的现象。如图4所示, 4份样本(循环数34, 模板量3μ L)均出现不同程度的峰值偏差和等位基因丢失。这主要是Taq酶的活性随着循环数的增加将明显下降, 同一基因座的两个等位基因在合成过程中受阻, 受阻程度较轻时表现为峰值偏差, 受阻程度较重时表现为等位基因丢失[4]。
 | 图4 模板量3μ L循环数34的4份样品部分基因座分型结果 |
据此, 作者建议, 在对粪便样本进行分析时, 应重复检验, 以保证最终检验结果的可靠性。
The authors have declared that no competing interests exist.
参考文献
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