引用本文
牛勇, 孙文平, 江南. 可卡因对小鼠离体腹腔巨噬细胞功能的影响[J]. 刑事技术,2012,37(4): 10-12
NIU Yong, SUN Wen-ping, JIANG Nan. Effects of cocaine on the function of mouse peritoneal macrophages in vitro[J]. Forensic Science and Technology,2012,37(4): 10-12  
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《刑事技术》编辑部
可卡因对小鼠离体腹腔巨噬细胞功能的影响
牛勇1, 孙文平2, 江南3
1.公安部五局六处,北京 100741
2.山东省泰山医学院病理生理系,271000
3.浙江省温州市公安局瓯海区分局,325000

作者简介:牛 勇(1977—),男,山东人,博士,研究方向:法医病理学与毒理学。Tel:010-66262997;E-mail:niuyong770204@163.com

基金: 国家“十五”重点科技攻关课题(No.2001BA801B04)
摘要

目的 研究可卡因对体外培养小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响。方法 无菌分离小鼠腹腔巨噬细胞,制备单细胞悬液,分别用不同浓度的可卡因作用于正常的和LPS活化的腹腔巨噬细胞。MTT法检测其增殖反应;ELISA法检测巨噬细胞培养上清中TNF-α的分泌水平;生物活性检测法检测IL-1的活性。结果 可卡因在终浓度10、20和100μg/mL时能明显抑制LPS刺激的腹腔巨噬细胞增殖反应,减少TNF-α、IL-1的释放,与对照组相比较有显著性差异( P﹤0.01)。结论 可卡因对体外培养腹腔巨噬细胞功能有明显抑制作用。

关键词: 法医毒理学; 可卡因; 巨噬细胞; 肿瘤坏死因子-α; 白细胞介素-1
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2012)04-0010-03
Effects of cocaine on the function of mouse peritoneal macrophages in vitro
NIU Yong, SUN Wen-ping, JIANG Nan
Criminal Investigation Department, Ministry of Public Security, Beijing 100038,China
Abstract

Objective To investigate the effects of Cocaine on the function of mouse peritoneal macrophages in vitro.Methods The single cell suspension of murine peritoneal macrophages was prepared under sterile condition. Different concentrations of Cocaine were added to the normal or LPS-activited peritoneal macrophages. The cell proliferation of macrophages was measured by MTT assay. Concentrations of TNF-α in supernatants were determined by using quantitative sandwich enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) kits. The activities of IL-1 were detected by biological assays.Results Compared with those of the normal control groups, the LPS-induced peritoneal macrophages proliferative reactions was inhibited when the cells were exposed to Cocaine ranging from 10μg/mL to 100μg/mL. The productions of TNF-α and IL-1 in supernatants were all reduced markedly( P﹤0.01).Conclusion Cocaine can inhibit the mouse peritoneal macrophages function in vitro.

Keyword: forensic toxicology; cocaine; macrophages; TNF-α; IL-1

可卡因(Cocaine)是最强的天然中枢兴奋剂, 是当今世界上主要的成瘾性药物之一。迄今为止, 科学家对可卡因的研究主要集中在其成瘾机制、对心血管、神经、生殖等系统的损害、可卡因的体内代谢及检测方法, 以及如何开发预防可卡因滥用的疫苗等领域[1]。有研究表明, 可卡因静脉注射能增加艾滋病、重症感染的风险, 其作用机制复杂, 涉及多重因素的共同影响[2, 3, 4]。本实验以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象, 采用体外细胞培养途径给药, 观察可卡因对小鼠腹腔巨噬细胞的LPS增殖反应、TNF-α 和IL-1的分泌水平, 来探讨可卡因对机体免疫功能的影响。

1 材料与方法
1.1 材 料

1.1.1 动物与试剂 615纯系雄性小鼠, 7~8周龄, 重量(20± 2)g, 由中国医科大学实验动物研究中心提供[生产许可证号:SCXK(辽)2003-0009, 使用许可证号:SCXK(辽)2003-0013]。于实验前自由食水适应性饲养1周。

盐酸可卡因(购于国家麻醉品实验室), 白色粉末, 纯度≥ 99%, 实验前用10%新生牛血清(NBS)RPMI 1640培养液配制成所需质量浓度, 在4℃~6℃下保存备用, 四甲基偶氮唑蓝(MTT)、伴刀豆球蛋白A(ConA)和脂多糖(LPS)(美国Sigma公司), 小鼠肿瘤坏死因子-α (TNF-α )检测试剂盒(美国BPB公司), RPMI1640培养粉、新生小牛血清(美国Gibco公司), 其余试剂均为分析纯(AR)。

1.1.2 仪器与设备 DDL-5型低速冷冻离心机、TGL-16G型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器有削有限公司), HH.CP-01W型二氧化碳细胞培养箱(上海博迅医疗设备厂), DL-CJ-1F实验医用型洁净工作台(吴县市苏杭净化设备厂), Bio-Rad 550型酶联免疫检测仪(美国Bio- Rad公司), CX-21型Olympus普通光学显微镜(日本奥林巴司光学工业株式会社)。

1.2 方 法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬细胞悬液的制备 颈椎脱臼处死615纯系雄性小鼠, 75%酒精浸泡3min。无菌下丁字形剪开皮毛漏出腹肌, 腹腔注射10mL冷Hanks液, 轻揉腹部1min~2min后吸取腹腔液于离心管中, 3000r/min离心5min, 弃上清, 沉淀再悬浮, 共洗涤3次。末次沉淀用含10% NBS的RPMI1640培养液2mL悬浮, 调整细胞浓度至1.0× 109/L。以每孔200μ L接种于96孔板中, 置37℃, 5% CO2及饱和湿度条件下培养4h, 去上清及未贴壁细胞, 即得纯化的腹腔巨噬细胞。

1.2.2 设计及分组 在96孔培养板上, 每孔加入100μ L完全培养基, 空白组另加10% NBS-RPMI1640培养液100μ L, 对照组加含LPS(终浓度5mg/L)的10% NBS-RPMI1640培养液100μ L, 实验组加入含可卡因(终浓度分别为10μ g/mL、20μ g/mL、100μ g/mL)的LPS(终浓度5mg/L)-10% NBS-RPMI1640培养液100 μ L, 每孔总容积200μ L, 每份样品设3个复孔。置37℃, 5% CO2及饱和湿度条件下, 连续培养48h。

1.2.3 MTT法测定巨噬细胞增殖反应 细胞培养48h后, 每孔加入MTT(5g/L)10μ L, 混匀再培养4h后, 吸弃上清液, 每孔加入DMSO 100μ L, 旋涡震荡器震荡5min, 在酶标仪上测定490nm处吸光度, 结果以 x¯± s表示。

1.2.4 IL-1的测定方法 采用小鼠胸腺细胞增殖法检测IL-1活性。颈椎脱臼处死小鼠, 超净工作台中打开小鼠胸腔, 取出胸腺, 放入含有5% NBS的Hanks液中研磨使成单个细胞, 200目尼龙筛网滤过倒入具塞离心管中, 3000r/min离心5 min, 弃上清, 沉淀用含5% NBS的Hanks再悬浮, 共洗涤3次。末次沉淀用含10% NBS的RPMI1640培养液悬浮细胞, 置37℃, 5% CO2培养箱中培养4h, 除去贴壁的巨噬细胞, 悬浮的即为小鼠胸腺淋巴细胞, 调整细胞浓度至1.0× 109/L备用。

取前述各组腹腔巨噬细胞培养上清液50μ L分别加入96孔板, 每孔另加含ConA(终浓度3mg/L)的10% NBS-RPMI1640 培养液50μ L和1.0× 109/L小鼠胸腺细胞悬液100μ L, 每孔总容积200μ L, 设3个复孔。置37℃、5% CO2培养箱内培养48h后, 每孔加入5g/L的MTT 10μ L, 继续培养4h后, 去上清, 加DMSO 100μ L, 旋涡震荡器震荡5min, 用酶标仪在OD490nm处读A值, 结果以 x¯± s表示。

1.2.5 TNF-α 的测定方法 采用酶联免疫法(ELISA)检测培养上清液中TNF-α 的含量, 具体操作方法按照试剂盒说明进行。在酶标仪490nm处检测吸光度。

1.3 数据统计及处理

实验数据以± s表示, 采用t检验统计分析。

2 结 果
2.1 可卡因对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞增殖的影响

由表1可见, 与空白组相比较, 对照组小鼠腹腔巨噬细胞在LPS诱导下增殖迅速(P< 0.01)。与对照组相比较, 实验组在加入的可卡因后, 增殖反应明显降低(P< 0.01), 且呈明显的剂量依赖性效应。

表1 可卡因对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞增殖的影响(n=10, x¯± s)
2.2 可卡因对小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1的影响

表2结果表明, 体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞在LPS刺激下, IL-1的分泌量显著增加(P< 0.01), 在加入不同剂量的可卡因后, 能显著抑制LPS刺激的IL-1的释放量, 且呈现剂量依赖性, 与对照组相比较有显著性差异(P< 0.01)。

表2 可卡因对小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1的影响(n=10, x¯± s)
2.3 可卡因对小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α 的影响

由表3可知, 在LPS的刺激下, 巨噬细胞培养上清液中TNF-α 的含量明显增加(P< 0.01), 与对照组相比较, 加入不同剂量的可卡因后, 在细胞培养上清中产生的TNF-α 含量明显减少, 这种效果呈明显的剂量依赖性(P< 0.01)。

表3 可卡因对小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α 的影响(n=10, x¯± s)
3 讨 论

巨噬细胞是机体重要的免疫细胞, 是宿主抵抗病原微生物侵袭的首要防线, 具有抗肿瘤、抗感染等免疫监视、免疫防御等作用, 在固有免疫应答中发挥重要作用, 并参与特异性免疫应答。巨噬细胞通过吞噬异物、细菌、衰老和突变的细胞维持免疫稳态, 活化的单核巨噬细胞具有广谱杀瘤作用, 并可分泌多种细胞因子, 参与固有和获得性免疫调节[5]。近年来研究证实, 活化的巨噬细胞能合成并分泌多种生物活性物质, 如NO、TNF-α 、IL-1、IL-6等, 其中多种因子参与炎症反应的发生发展[6]。TNF-α 、IL-1等为前炎症细胞因子和炎症早期因子, 是启动炎症反应的关键细胞因子。TNF-α 是细胞因子网络的启动因子, 在炎症反应中它不仅能直接参与炎症反应, 还能诱导其他细胞因子的释放, 共同造成组织损伤。它与其他细胞因子形成相互作用的信号网络, 刺激细胞合成、分泌IL-1[7]。IL-1能诱导出与TNF-α 相似的生理和代谢改变, 二者能协同作用引起炎症发生时的血流动力学效应和白细胞介导的组织细胞坏死, 导致器官衰竭[8]。

本实验通过采用体外细胞培养的方法, 利用LPS诱导巨噬细胞产生炎症因子并使用不同浓度的可卡因进行干预, 观察可卡因对小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α 、IL-1生成的影响。结果表明:可卡因能抑制LPS诱导的细胞增值反应, 显著降低巨噬细胞合成TNF-α 、IL-1的能力。说明可卡因能有效抑制巨噬细胞的功能, 减弱其参与炎症反应和抗肿瘤等能力, 导致机体对病毒、细菌等病原微生物入侵的抵抗力下降, 削弱机体的免疫功能。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 孙文平, 卢延旭. 可卡因的毒理学研究进展[J]. 中国药理学通报, 2004, 20(11): 1212-1214. [本文引用:1]
[2] Anthony JC, Vlahov D, Nelson KE, et al. New evidence on intravenous cocaine use and the risk of infection with human immunodeficiency virus type I[J]. Am J Epidemiol, 1991 134: 1175-1189. [本文引用:1]
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