引用本文
史月群, 胡兰. SYBR Green I实时荧光PCR技术在人类DNA定量中的应用[J]. 刑事技术,2012,37(3): 9-12
SHI Yue-qun, HU Lan. Application of real-time quantitative PCR (SYBR Green I) technique in forensic science[J]. Forensic Science and Technology,2012,37(3): 9-12  
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《刑事技术》编辑部
SYBR Green I实时荧光PCR技术在人类DNA定量中的应用
史月群1,2, 胡兰3
1.中国人民公安大学,北京 100038
2.广东省珠海市公安局,519075
3.公安部物证鉴定中心,北京 100038

作者简介:史月群(1973— ),女,浙江人,副主任法医师,在读硕士,主要从事法医学DNA分析技术的检案与应用研究工作。Tel:(0756)8642262

摘要

目的 建立SYBR Green I实时荧光定量PCR技术在法医物证检验中的应用。方法 应用SYBR Green I实时荧光定量PCR技术对各种生物检材进行定量分析,并在此基础上进一步分析STR。结果 得到了实验的各种生物检材的准确定量。结论 SYBRSYBR Green I实时荧光定量PCR技术是一种高效且廉价的检测基因拷贝数的方法,具有法医学应用价值。

关键词: 法医物证学; 荧光定量PCR技术; DNA定量; 短串联重复
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2012)03-0009-04
Application of real-time quantitative PCR (SYBR Green I) technique in forensic science
SHI Yue-qun, HU Lan
Chinese People's Public Security University, Beijing 100038,China
Abstract

Objective To apply the real-time quantitative PCR assay with the SYBR Green I to DNA analysis in forensic science.Methods DNA abstracted from variety of biological samples encountered in forensic science were quantitated by using the SYBR Green I, and the subsequent procedures of STR testing were then conducted.Results The quantity of DNA of variety of biological samples was obtained.Conclusion Real-time quantitative PCR is useful technique for DNA analysis in forensic science.

Keyword: forensic biological evidence; fluorescent quantitative PCR; quantification; STR

实时荧光定量PCR技术(rea1time quantitative PCR, RT-Q-PCR)是一种在PCR反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程, 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[1, 2]。该技术不仅实现了对DNA模板的定量, 而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点, 目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。

在法庭科学领域, 通过DNA荧光定量能够确定法医现场生物检材的DNA含量, 从而大大提高现场生物检材DNA分型的成功率。目前只有ABI公司和Promega公司以TaqMan探针为基础建立了定量分析方法[3, 4], 国内尚未见相关研究的报道。但TaqMan[5, 6]只能用于单次特异反应中, 且价格也比较昂贵。本研究拟采用价格低廉的SYBR Green I荧光染料所具有的非特异性, 选择特异性高的基因组区段, 检测常染色体上DNA量, 以建立起一种高效且廉价的检测基因拷贝数的方法。

1 材料与方法
1.1 实验材料

人生物检材样本来自广东省珠海市公安局DNA实验室2010年~2011年日常受理的案件检材, 包括现场血迹、衣物血渍、烟蒂、人体组织共28例; 其他生物样品包括狗、牛、鱼、小鼠的血液, 水稻, 拟南芥叶片, 大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的菌体。

1.2 实验方法

1.2.1 样品及标准品的准备 受理的案件中的现场血迹、衣物血渍、烟蒂、人体组织、狗、牛、鱼、小鼠血渍采用chelex-100方法提取DNA; 水稻, 拟南芥叶片, 大肠杆菌和枯草芽孢杆菌采用有机法提取DNA。

将人类标准DNA(200ng/μ L)(美国AB公司Quantifiler Human DNA Standard)稀释成以下5个梯度, 浓度分别为:10ng/μ L、1ng/μ L、0.1ng/μ L、0.01ng/μ L、0.001ng/μ L, 标记为St.1-St.5。

1.2.2 荧光定量扩增 扩增体系为25μ L, 含SYBR RRPremix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus, 宝生物工程有限公司)12.5μ L, 引物(Invitrogen公司合成)2μ L, 模板2μ L(包含待测样品, 标准品, 阴性阳性对照), 补水至25μ L。引物信息见表1。

表1 本研究所用的引物信息

应用Eppendorf Mastercycler ep realplex型定量PCR仪进行定量反应, 扩增程序为94℃ 1min后, 94℃ 15s, 60℃ 1min, 共40个循环; 然后进行熔解曲线分析。

1.2.3 数据收集和分析 应用Database Tool进行数据收集, 用reaalplex进行数据分析, 生成标准曲线。通过标准曲线计算样本DNA浓度。

1.2.4 STR分型 根据定量结果, IdentifilerTM体系扩增, ABI3130xl基因分析仪电泳分离分析, 得到分型结果。

2 结 果
2.1 熔解曲线结果

对浓度分别为10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng的人类标准DNA各3组进行熔解曲线分析, 通过Mastercycler ep realplex分析软件得出引物组SG6的熔解曲线为单一峰, 平均熔解温度在85.4℃(见图1)。

图1 引物SG6溶解曲线

2.2 引物SG6扩增原始图谱及Ct值(见图2, 表2)。

图2 引物SG6扩增原始图谱

表2 引物SG6扩增模板浓度总量分别为10ng, 1ng, 0.1ng, 0.01ng, 0.001ng的Ct值
2.3 标准曲线结果

通过Mastercycler ep realplex分析软件得出引物SG6的斜率是-3.229, 扩增效率为1.04, 标准曲线相关系数R2为0.999(见图3)。

图3 引物SG6扩增效率、斜率及相关系数(R2)

2.4 定量结果

上述常规案件DNA定量结果见表3, 其中Y1~Y8为现场血迹、Y9~Y16为衣物血渍、Y17~Y24为烟蒂、Y25~Y28为人体组织, 各检材均用chelex-100方法提取DNA, 模板DNA都取2μ L, 在相同体系相同循环参数条件下, 用引物组SG6定量的DNA浓度大多集中在0.01ng/μ L至1ng/μ L。

表3 引物组SG6常规案件DNA定量结果
2.5 物种特异性结果

一般的案件取材都有可能会引入外源DNA的污染, 外源DNA包括动物的血迹组织、植物的叶片、微生物等。所以引物的物种特异性在荧光定量中也是非常重要的因素。本实验取常见动物狗、牛、鱼、小鼠的血液, 水稻, 拟南芥叶片, 大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的菌体, 提取其全基因组。用引物SG6扩增得到其Ct值(见表4)。从表4可以看出Ct值大于30, 当Ct大于30时可认为并未扩增到目的片段。

表4 引物组SG6扩增得到其Ct值
3 讨 论

理想的实时荧光定量体系应该具备以下特点:(1)PCR扩增产物特异性高; (2)理想的PCR效率(90%~105%); (3)理想的重复性; (4)较宽的灵敏度。SYBR Green I实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中, 加入过量SYBR Green I荧光染料, SYBR Green I荧光染料特异性地掺入DNA双链后, 发射荧光信号, 而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号, 从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。随着PCR反应的进行, PCR反应产物不断累计, 荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环, 收集一个荧光强度信号, 这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化, 从而得到一条荧光扩增曲线图。它的缺点在于能与非特异性双链DNA(如引物二聚体)结合, 但其产生的干扰可通过设计特异性引物, 建立并优化SYBR Green I实时荧光PCR检测鉴定体系得到解决。国内徐君怡等人曾对虎制品用SYBR Green I实时荧光PCR进行特异性鉴定[7]。本研究针对人类DNA一共设计SG1-SG7共7组引物, 通过研究验证了引物SG6可以扩增出单一的目标序列, 扩增效率为104%, 斜率是-3.229, 标准曲线相关系数R2为0.999, 并具有良好可重复性。

通过研究, 可以看到引物SG6在扩增的浓度梯度范围在10ng, 1ng, 0.1ng, 0.01ng, 0.001ng有正常的Ct值, 并且很好地体现了扩增趋势, 表明用此种方法灵敏度可达到0.001ng, 与美国AB公司的人类DNA定量试剂盒采用的TaqMan探针方法灵敏度0.023 ng相比高出20倍以上; 与国内刘歆等人报道的基于SYBR Green I的双链DNA定量方法[8]灵敏度0.015ng相比也高出10倍以上。

从引物SG6扩增案件的实验数据可以看出, 测定得到的DNA含量均在引物自定的标准曲线之内。从物种特异性实验可以看出, 引物SG6对狗、牛、鱼、小鼠、水稻、拟南芥、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌扩增都为阴性。因此, 引物SG6可以应用于案件中的DNA定量, 并且具有良好的线性范围和物种特异性, 具有法医学应用价值。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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[6] 李成涛, 林源, 柳燕, 等. 实时DNA定量技术的应用研究[J]. 中国司法鉴定, 2007: 28-30. [本文引用:1]
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[8] 刘歆, 徐根明, 郭江峰, 等. 基于SYBR Green I的双链DNA定量方法. 中国生物工程杂志, 2008, 28(1): 55-60. [本文引用:1]