Dionex ASE 300 型快速溶剂萃取仪(美国戴安公司); J2 AccuPrep MPS ^TM凝胶渗透色谱仪(美国J2 Scientific公司); Shimadzu 2010型GC/NPD, 均配以AOC-20i自动进样器, (日本岛津公司)。EYELA CUTE MIXER CM100高速振荡器、Thero高速离心机、DSY-Ⅱ 快速浓缩仪。

GC/NPD 条件:DB-5弹性毛细管柱 30m× 0.25mm× 0.25μ m, 柱温程序:200℃(1min)10℃/min 280℃(15min); 进样口温度280℃, 检测器温度300℃; 载气He, 流量 1mL/min, 分流比 5:1。

ASE条件:加热炉温度100℃, 加热时间5min, 静态萃取时间5min, 萃取溶剂乙酸乙酯:环己烷(1:1), 用60%溶剂冲洗, 氮气吹扫时间90s, 静态萃取次数1次。

GPC条件: 50%乙酸乙酯/50%环己烷的GCP色谱柱; 流动相为乙酸乙酯:环己烷(1:1) ; 流速:4.7mL· min^-1 ; 杂质丢弃时间7min; 收集时间10min。

佐匹克隆、扎来普隆、唑吡坦、阿吡坦标准品购于中国药物检验所。

精确称取10.0mg标准品溶于10.0mL 甲醇溶液中, 配成1.0mg· mL^-1储备液放置于冰箱中待用。将以上储备液逐级稀释成0.1、0.01、0.001mg· mL^-1工作液。

环己烷、乙酸乙酯、氧化铝均为色谱纯, 硅藻土购自美国戴安公司。

空白全血(经肝素抗凝)采自健康志愿者, 空白猪肝购至超市。

取1.0mL血或1.0g肝剪碎加入到装有2g硅藻土的蒸发皿中混匀, 再倒入到已装有1g硅藻土的10mL萃取池中, 置于快速溶剂萃取仪上进行萃取。

萃取液浓缩5mL, 供凝胶色谱进行净化, 获得净化液置于50℃浓缩仪上挥干, 100μ L定容供GC分析。

2.1.1 加热温度的选择 实验比较了添加1μ g标准品时, 加热炉温度在80、100、120、150℃条件下的萃取效果。数据显示100℃以上, 非苯二氮卓类催眠药回收率明显增加, 但从色谱图上来看, 温度越高杂质也越多。兼顾回收率和杂质两个因素, 选择100℃为加热炉温度。

2.1.2 静态萃取时间和循环次数的选择 实验比较了添加1μ g标准品时, 静态萃取时间在5、10、15min条件下的萃取效果和循环次数为1次、2次、3次的萃取效果。数据显示随着萃取时间以及循环次数的增加回收率并未增加, 反而增加了整个萃取时间。为达到时间短回收率高的目的, 选择5min的静态萃取时间和1次的循环次数。

2.1.3 pH值的选择和萃取溶剂的选择 实验比较了添加1μ g标准品时, pH值在7, 8, 9, 10, 11(各加2mL 相应pH值的缓冲液)条件下的回收率。数据显示, 在pH 7即中性下, 回收率则能达到较高水平。随着pH值的升高并不能明显提高回收率, 因此, 选择在中性条件下萃取。实验还比较了乙酸乙酯/环己烷, 乙酸乙酯, 二氯甲烷的回收率。数据显示以乙酸乙酯/环己烷回收率较高。

2.1.4 氧化铝的添加 实验比较了添加中性氧化铝前后的色谱图和回收率的变化。数据显示添加2g氧化铝会增加色谱图中的杂质成份, 背景的本底也会增加, 而且回收率有一定的降低。因此添加氧化铝并未达到预期的净化效果。

2.2.1 专属性实验 在选定的仪器条件下, 各目标物具有良好的色谱峰。在该色谱条件下分析生物样品, 添加与空白相比较无杂质干扰(见图1, 图2), 表明该方法具有较好的专属性, 佐匹克隆保留时间为8.3min, 唑吡坦保留时间为13.6min; 扎来普隆保留时间为17.3min; 阿吡坦保留时间为20.5min。

图1

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	图1 经ASE处理后的1μ g血添加

图2

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	图2 经ASE处理后血空白

2.2.2 工作曲线与检测限 取空白血样品1mL, 加入一定量的佐匹克隆等4种标准品, 配制成浓度为0.1、 0.5、 1 、2、5μ g/mL的添加血液样品, 按ASE方法处理样品并进行仪器分析。以浓度对相应的峰面积进行线性回归, 得到血液回归方程及相关系数, 并按信/噪比(S/N)≥ 10, 计算得检测限(见表1)。

表1

表1

表1 血液中4种催眠药的线性方程 名称 回归方程 线性范围 (ng/mL) R2 LQD (ng/mL) 佐匹克隆 Y=139865X-12342 0.1~5 0.9950 0.1 唑吡坦 Y=417296X+67412 0.1~5 0.9963 0.05 扎来普隆 Y=282687X-402 0.1~5 0.9989 0.05 阿吡坦 Y=197290X-14955 0.1~5 0.9987 0.1

表1 血液中4种催眠药的线性方程

表2

表2

表2 ASE回收率和精密度 名称 平均回收率 精密度(%) 日内 日间 佐匹克隆 87.6% 5.4% 16.3% 唑吡坦 91.2% 6.3% 13.4% 扎来普隆 93.8% 6.5% 11.7% 阿吡坦 83.4% 7.2% 15.1%

表2 ASE回收率和精密度

2.2.3 ASE回收率 取空白血1mL, 加入一定量的佐匹克隆等4种标准品, 配制成浓度为0.5、1、5μ g/mL的血液样品, 按ASE处理样品并进行仪器分析。每个浓度平均3份, 测得的峰面积和对应浓度的标准品峰面积的比率为平均回收率。按上述方法每个浓度平行分析3份, 得日内精密率(RSD), 连续三天每天分析1份, 得日间精密率RSD(见表2)。与非苯二氮卓类的液液萃取方法相比, ASE方法的回收率普遍较高, 结果较为满意, 这与其高温高压有较大的关系, 但精密度方面并不如液液萃取方法。

2.2.4 GPC净化结果 ASE萃取后, 用GPC来进行净化, 净化前后的色谱图进行比较(见图3、图4), 显示净化后本底降低, 杂质减少。图5为肝添加样品经GPC处理后的色谱图, 较为干净。

图3

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	图3 空白肝GPC净化后的色谱图

图4

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	图4 空白肝GPC净化前的色谱图

图5

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	图5 肝添加样品经GPC处理后的色谱图

本文建立了生物样品中非苯二氮卓类催眠药的ASE和GPC方法。与液液萃取相比, 快速溶剂萃取法具有有机溶剂用量少、快速、基体影响小、萃取效率高、安全性好等特点。与传统的净化方法相比, GPC方法具有自动化程度高、使用方便的优势。同时作者注意到其有不足之处, 比如, ASE萃取精密度不高等缺点。

因此笔者认为对新鲜样品中非苯二氮卓类催眠药可采用传统的液液萃取或固相萃取可获得准确定性定量结果, 对一些腐败样品和油脂、色素较大的样品或者半定量的样品, 应用ASE和GPC方法具有较快较理想的效果。