金属表面DNA提取检测方法
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张子龙, 孙红兵, 盛清平, 杨鑫. 金属表面DNA提取检测方法[J]. 刑事技术,2012,37(3): 48-49
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金属表面DNA提取检测方法
关键词:
DNA; 金属离子; DNA浓度; 提取方法
中图分类号:DF795.2
文献标志码:B
文章编号:1008-3650(2012)03-0048-02
本实验通过比较4种常规提取方法对金属表面DNA提取效果进行观察, 并改进常规提取过程中试剂配比及操作流程, 初步建立了留存在金属表面DNA的提取方法。
1 材料及方法
1.1 材 料
2008年至2010年发生的刑事案件中收集到沾染有血迹的金属物品(兰州市公安局DNA实验室提供)30件, 其中生铁制品22件(生铁制品表面均已生成锈斑), 不锈钢制品8件。用棉签滴蘸去离子水转移金属表面斑迹并进行抗人血红蛋白检测, 结果均为阳性。
9700型PCR扩增仪(AB)、7500荧光定量PCR(AB)、3130XL遗传分析仪。
1.2 提取方法
1.2.1 chelex-100Ⅰ 提取法[1, 2] 剪取棉签(面积约为0.2cm× 0.2cm)放入1.5mL Eppendorf管中, 加入1.0mL去离子水室温浸泡30min, 12000r/min离心, 去上清, 1.0mL去离子水洗涤3遍, 加入0.1mL 5%Chelex-100溶液(同时做10%浓度比较试验)和8μ L 1%蛋白酶K, 56℃水浴1h, 震荡10s, 98℃水浴8min~10min, 12000r/min 离心3min, 备用。
1.2.2 纯化柱 纯化柱提取参照QIAamp DNA Blood Kits纯化试剂盒使用说明书。
1.2.3 磁珠法 磁珠法提取参照IQTM磁珠提取试剂盒使用说明书。
1.2.4 chelex-100Ⅱ 提取法 剪取棉签(面积约为0.2cm× 0.2cm)放入1.5mLEppendorf管中, 加入1.0mL去离子, 室温浸泡30min, 每10min震荡10s, 12000r/min离心, 去上清, 1.0mL去离子水洗涤2遍, 加入50μ L 10% Chelex-100溶液、8μ L 1%蛋白酶K、1μ L cRNA, 56℃水浴1h(水浴30min加入30μ LSDS), 每20min加入20μ L 5%Chelex-100溶液震荡, 加入30μ L Tween-20(0.05%), 56℃水浴30min, 震荡, 98℃水浴8min~10min, 13000r/min离心3min, 备用。
1.3 扩 增
检材定量结果DNA浓度高于0.02ng/μ L样本按比例用去离子水稀释至0.02ng/μ L, DNA浓度低于0.02ng/μ L的样本按原有浓度进行STR检测。应用ABI公司的Amp FISTR IdentifilerTM试剂盒进行复合扩增, PCR反应在ABI-9700金座扩增仪上进行28个循环扩增。
1.4 检 测
1.4.1 荧光定量 绝对定量实验参照ABI7500实时定量PCR仪操作指南, 具体数据见表1。
 | 表1 30例样本检测及四色荧光分析结果 |
1.4.2 STR检测 STR检测参照ABI3130XL基因分析仪操作指南, 收集结果用Genemapper ID v3.2软件进行基因型分析。
2 结果与讨论
以2008Y169案件为例, 现场物证提取一木把菜刀, 菜刀表面有锈红色痕迹, 抗人Hb试纸检验为阳性, 表明有人血残留。经chelex-100Ⅰ 提取法、chelex-100Ⅱ 提取法、纯化、磁珠法等4种方法提取DNA并检测, 结果如图1。
 | 图1 4种方法提取现场菜刀上血迹DNA图谱A:纯化柱提取; B:优化Chlexe-100法提取; C:10% Chlexe-100提取; D:磁珠法提取 |
检测结果表明, 4种提取方法对不锈钢材质表面血液DNA含量影响不大; 但是在锈迹菜刀上提取DNA含量有明显差异, 分别为:磁珠法0.01ng/μ L< Chelex-100Ⅰ 提取法0.047ng/μ L< chelex-100Ⅱ 提取法0.055ng/μ L< 纯化柱0.088ng/μ L。造成差异的可能原因为:(1)磁珠法提取不锈钢材质表面血液DNA检材绝对浓度明显小于其他几种方法; (2)纯化柱能有效地减少干扰PCR扩增的抑制因素, 从而高效回收、纯化模板DNA, 但是使用成本较高; (3)chelex-100Ⅱ 提取法于其他几种方法相比, 在降低使用成本的同时有效地提高了模板DNA的回收效率。
Chelex-100是一种螯合型的离子交换树脂, 由交联聚苯乙烯凝胶和亚胺基乙烯乙酸等组成, 后者作为螯合基团可与金属离子结合, 阻止金属离子在高温和低离子强度下作为催化剂降价DNA[3], 且不影响需Mg2+的PCR反应。本文在实际案件操作中适当加大Chelex-100的浓度, 结果表明能有效地提高本文所涉及检材模板DNA的回收率(锈斑血迹5%chelex-100Ⅰ 提取法检出16个基因座, 检出率为4.5%; 10%chelex-100Ⅱ 提取法检出16个基因座, 检出率为13.5%)。
(感谢兰州市公安局刑警支队刑事科学技术研究所DNA实验室全体警务人员对本文的支持)
The authors have declared that no competing interests exist.