随着DNA检验灵敏度的提高, 越来越多的案件需进行微量生物检材DNA的检验, 本实验室应用96孔板批量提取微量生物检材DNA, 大大提高了检案效率, 在案件中发挥了重要作用。现介绍如下:
取细轴棉棒用TES浸湿棉棒上棉签后擦拭送检物品(如绳索、胶带、打火机、螺丝刀等)上可能有脱落上皮细胞的部位, 剪取棉签表面约0.5cm× 0.3cm大小依次放入96孔板中, 每孔中加入70μ L TES、10μ L 10%十二烷基肌氨酸钠及2μ L 10mg/mL PK, 56℃消化20min后99℃煮沸10min, 每孔加入150μ L吸附液, 3000r/min离心1min, 用排枪转移上清至一干净96孔板中, 每孔加入10μ L硅珠悬液, 室温静置5min, 3000r/min离心15s; 弃上清, 沉淀物中加入200μ L冷70%乙醇, 充分悬浮沉淀物, 3000r/min离心15s, 将乙醇弃去, 重复一次; 烘干; 每孔加入10μ L去离子水, 充分溶解沉淀物, 56℃保温15min, 3000r/min离心1min; 取上清液1μ L~3μ L进行PCR反应(试剂的配制见文献[1])。
扩增引物采用AB公司提供的AmpFISTR Identifiler Plus试剂盒。扩增总体积6μ L, 其中含:PCR反应混合物2μ L, 引物1μ L, 模板1μ L~3μ L, 用去离子水补足体系。反应条件为:95℃× 11min× 1cycle, 94℃× 20s/59℃× 3min× 28cycle, 60℃× 20min。
扩增产物经ABI3100型遗传分析仪检测, 取1.5μ L扩增产物加入含有10μ L上样液(10μ L甲酰胺中加入0.2μ L Genescan 500LIZ作为分子量内标)中。
案例1 某年9月23日夜, 某镇徐某在家遭一男子入室抢劫并受伤。技术人员提取捆绑受害人的白色包装带送检, 要求检验嫌疑人的DNA, 笔者经对送检包装带分二十余段批量提取DNA, 结果其中两处检出同一未知男性的DNA, 且通过数据库比对, 该分型数据比中嫌人员童某, 案件告破。
案例2 某年5月16日, 某单位一台笔记本电脑被盗, 技术人员提取现场鼠标和电源线送检, 笔者经对送检物品分段转移提取共三十余处进行批量检验, 最终在鼠标和电源线上各检出一处男性DNA, 且分型一致, 经入库比对, 该数据比中嫌人员谷某, 并串并案件21起, 谷某供认不讳。
案例3 某年5月17日, 某市区一13个月的孩子及保姆被杀害在家中。技术人员提取了捆绑保姆的胶带送检, 笔者经在胶带的粘面、光滑面及胶带卷的侧面共提取了50多处批量检验, 终于在胶带卷的侧面成功地检出一处混合DNA, 为保姆与一男子DNA的混合, 经数据分析得到嫌疑人的分型数据, 为这起恶性命案的最后侦破提供了强有力的证据。
随着DNA技术的发展, DNA检验的灵敏度越来越高, 微量生物检材的送检亦成为常规, 大量的盗窃、抢劫等刑事案件中均涉及微量生物检材的检验, DNA检验人员往往需一次检验二三十个案件八九十份检材, 96孔板批量提取DNA一次可最多处理九十多个样品, DNA提取及扩增前加样整个过程仅需2小时, 大大提高了检验效率。
在对现场检材进行转移时要用半干细棉签反复擦拭, 棉签过湿则转移不彻底, 棉签过干则脱落细胞转移不下来; 且擦拭范围要适中, 擦拭的范围过小则提取到的细胞过少而无法检验, 擦拭的范围过大则污染的可能性变大, 如案例1中对包装带的擦拭范围过大则容易检出混合DNA, 不利于案件的排查[2]。
由于潜在物证肉眼无法判断细胞所在位置, 检验人员须通过案情结合生活常识分析所在位置, 传统的单管提取DNA法在检材较多时操作繁琐, 耗时长, 且易出错, 而对转移面积较大的检材(如电线、胶带、窗棂、绳索、大力钳等), 检验人员为了尽快出结果, 往往转移粗糙, 出现盲区, 而采用96孔板批量提取DNA则可以做到网格式提取, 提高检出率, 如案例3中, 如只在胶带上粗略地转移一二十处, 可能就得不到嫌疑人的数据, 而批量提取DNA的高效性使得检验人员更有耐心地开展更为细致的工作。
对于微量生物检材, 提取DNA时应尽可能浓一些, 最后只加10μ L去离子水, 加去离子水量过多导致扩增时模板太少, 扩增不成功, 加去离子水量过少易出现非特异性扩增。
The authors have declared that no competing interests exist.
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