强酸消化法是硅藻检验的传统方法, 是目前法医学实践中最常用的一种检验方法。此法采用硝酸和乙醇(或乙醚)消解组织, 具有组织消解时间短、消解完全、程序简单、成本低等优点, 是目前我国实际检案中的一种标准化方法^[6]。梁新华等^[7]曾报道强酸消化法对肝、肾、肺的消化能力显著强于胰蛋白酶消化法。但是此法安全性较差, 易造成污染, 而且最后检测到的多是一些耐酸性的无机硅藻, 其他类型硅藻则容易被破坏^[8]。胡孙林等^[9]研究证实目前硅藻检验方法中所采用的离心处理步骤导致了部分硅藻损失。由于强酸对硅藻的破坏和反复离心造成的硅藻损失, 此法硅藻检出率较低, 在硅藻含量较低的肝脏和肾脏中, 极易得到假阴性的结果。但此法检验设备要求低, 操作简单, 现在仍然是全世界法医学实验室中普遍应用的方法。

近几年发展起来的微波消解法为消解各类生物组织的先进方法。

孙维琦等^[10]曾报道用光纤压力自控微波消解仪和压力可控密闭微波消解罐消解组织的方法。胡孙林等^[11]曾报道采用MW3000微波消解仪进行组织消解。此法具有高效、安全、环保、消解后的硅藻结构完整、残骸碎片极少的特点。

此法消解后的液体可以采用真空抽滤法富集硅藻^[11]。通过真空抽滤提取组织消解液中的硅藻, 可最大程度避免硅藻损失, 提高硅藻提取的回收率^[7]。但是由于微波消解的高温高压环境, 对硅藻的破坏可能较大, 在消化液真空抽滤后的扫描电镜照片中也能观察到较多的硅藻碎片, 目前此法对硅藻的破坏率尚未见到文献报道, 然而就目前的研究来看, 此法整体检出率仍明显高于传统硅藻检验方法。

蛋白酶为消解组织的另一种试剂。Ming等^[13]曾报道, 相比硝酸加过氧化氢、破机罐法和Soluene-350, 蛋白酶K是试剂中最好的选择。因为蛋白酶K消化后的结果显示出绝大多数的硅藻被回收和硅藻结构几乎都被保持。Takeichi等^[14]研究表明用蛋白酶K消化检验硅藻时, 可以用于福尔马林固定的组织, 且在具有高传染性疾病的尸体案件中推荐使用福尔马林固定的组织。何冠英等^[12]曾报道用胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K检验器官内的硅藻, 以胰蛋白酶的消化能力和检出率较优。梁新华^[7]等曾报道胰蛋白酶消化法的硅藻检出率均大于强酸消化法, 且均在肺脏硅藻检出率最高, 其次为肝脏, 肾脏硅藻检出率最低。此法操作简单、使用方便、经济实用、安全可靠, 适合于基层办案。

EG1和EG2蛋白普遍地存在于硅藻中, SK1蛋白只存在于中心纲属硅藻中, SK2蛋白只存在少部分中心纲属的硅藻中, 在人体组织及对照的实验植物中没有发现上述蛋白。suto等^{[15, 16]}使用PCR法, 通过检测这4种基因来鉴定水中尸体中的浮游生物。何方刚等^[17]采用PCR-DGGE法, 通过检测浮游生物中的16S rDNA来鉴定溺死。此法利用分子生物学技术直接对浮游生物16S rDNA进行检测, 其结果判断不依赖于浮游生物的形态学和理化特征, 具有极高的灵敏度和特异性, 同时能排除腐败菌的干扰。但是, 其技术相对复杂且成本较高^[9], 不允许硅藻种类的对比, 且不适合基层单位应用。不过, 如果通过更深入的研究, 能够测出硅藻种类间的特异性DNA序列, 此法将具有广泛的应用前景。

将检材逐渐加热至灰化, 用硝酸溶解, 加入蒸馏水, 过滤后镜检^[2]。徐三明等^[18]重新研究了经典高温灰化法对器官组织中硅藻检验, 认为仍属于操作简单、干扰少的有效方法。但是, 电灰化炉不甚普及, 普通坩埚灰化耗时费力, 温度和时间较难控制; 且温度需要600℃, 致硅藻大量被破坏、检出率较低。此法已经很少应用。

Soluene-350是一种主要用于液闪的消化试剂。王恩银等^[19]研究发现Soluene-350法不仅对淡水和海水藻类的检出率不高, 而且其消化能力远不如硝酸乙醇法和“ 破机罐” 法, 甚至低于酶消化法, 试剂来源也困难, 基本不适合在法医实践中的应用。

被检组织数块, 置于蒸馏水中浸渍数小时或过液; 或用硝酸钠处理浸渍液, 置37℃培养箱中24小时, 然后离心沉淀, 取残渣镜检。此法虽简单易行, 但硅藻检出率不高^[2]。

Terazawa等^[20]曾报道通过梯度离心实现浮游生物的分离富集。但离心前的组织匀浆化破坏了较大的浮游生物, 使得形态识别变得困难, 而且离心处理还会导致部分硅藻的损失。

目前国内外大多采用光镜检测硅藻。然而, 进入溺死尸体肝、肾、骨髓等脏器组织的硅藻一般个体小, 含量低, 如Pollanen等^[21]的研究表明溺死尸体骨髓内硅藻小于30μ m, 数量小于10个, 采用光镜检测时, 受放大倍数所限, 分析误差难以避免, 可能是导致硅藻检验备受争议的原因之一^[3]。胡孙林等^[11]首次采用扫描电镜自动扫描分析, 避免了光镜检测中逐个视野进行聚焦观察的方式, 大大降低了劳动强度, 而且根据高分辨硅藻扫描电镜照片进行硅藻种属认定, 提高了硅藻定性定量分析的准确度。

目前在利用硅藻检验结果鉴定溺死中所持的原则是:凡是组织(一般取肺膜下组织)检出硅藻为阳性, 肝、肾、牙齿和骨髓等器官也有硅藻, 且硅藻种类与实地水样一致, 即可诊断为溺死^[2]。单纯从肺中检出硅藻是不能作为溺死的诊断依据^[5]。

Hü rlimann等^[3]曾报道溺死的时候, 大的硅藻很可能只到达肺脏, 胃和十二指肠。另一方面, 小的硅藻可以进入血液、肝脏、肾脏甚至轻易进入骨髓。例如, 在骨髓中, 如果长度超过40μ m的非常大的硅藻或硅藻碎片被发现, 这就表明硅藻是通过胃肠道壁(活着的时候)或者死后(例如方法的问题)污染进入的。尽管硅藻小碎片在生前也可以进入身体, 但是把包括那些< 5μ m的硅藻全部考虑进来是合理的。然而, 以他们的经验来看, 在所有案件中这些小型硅藻都是来源于溺液中的类型, 而不是溺死前进入身体的。这个在小型硅藻占优势或者包含易于分解成小碎片的细长型硅藻的溺液中溺死的案件尤其容易理解。

当得到阳性结果后, 一个很重要的工作是判断该结果是否是由于污染造成的, 这也是硅藻检验中的一个难题。一般来说, 在肝、肾、骨髓中发现长度超过40μ m的硅藻, 则有存在污染的可能, 对于结果判断要慎重, 必要时可重复实验。笔者认为, 解决样本污染的问题, 关键在于检验样本的采集, 应该建立一种可以尽可能避免污染的标准化样本采集方法, 或者可以在不打开胸腹腔的情况下使用特殊器材封闭化采集样本。

内脏器官没有检测到硅藻为非溺死, 但有时还多见于死后抛尸入水或水中休克死或溺液中无硅藻的存在等^[2]。另外, 由于入水前的生理状态(酒醉、冠心病、癫痫发作等)、精神状态(被追打时的紧张、越狱逃跑后的恐惧等)以及身体状态(手脚被绑、戴手铐、严重受伤等)会缩短个体在水中的存活时间, 从而使进入组织脏器中的硅藻数量大大减少, 所以有上述生理、精神或机体异常的个体即使是生前入水, 也可能在组织脏器中无法检出硅藻^[22]。另外, 消耗方法对硅藻是否有过多的破坏, 特别是在离心的时候, 一些较小的硅藻会留在上清液中而被丢弃, 这在以小型硅藻存在为主的对内脏和骨髓的检验中显得尤为重要, 可能会使实验结果呈假阴性。