引用本文
亓冰, 张平, 张家栋, 钱静, 俞卫东, 胡兰. 低体系扩增技术在法医学中的应用综述[J]. 刑事技术,2012,37(1): 46-48
QI Bing, ZHANG Ping, ZHANG Jia-dong, et al. Application of low volume PCR in the forensic science[J]. Forensic Science and Technology,2012,37(1): 46-48  
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低体系扩增技术在法医学中的应用综述
亓冰1, 张平1, 张家栋1, 钱静2, 俞卫东3, 胡兰4
1.江苏省南京市公安局浦口分局,211800
2.南京医科大学法医系,210029
3.江苏省南京市公安局刑事科学技术研究所,210012
4.公安部物证鉴定中心,北京 100038

作者简介:亓 冰(1982—),男,法医师,硕士研究生,主要从事法医学检验鉴定工作。Tel:13914795594;E-mail:qibing821128@sina.com

摘要

降低扩增体系是提高微量DNA扩增灵敏度的手段之一。本文主要介绍了低体系扩增技术及其在国内外法医学领域应用的研究进展,并对低体系扩增技术解决法医学难题的应用前景进行初步探讨。

关键词: 低体系扩增技术; 法医学; 应用; 综述
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2012)01-0046-03
Application of low volume PCR in the forensic science
QI Bing, ZHANG Ping, ZHANG Jia-dong, et al
Pukou Branch of Nanjing Public Security Bureau, Nanjing 211800, China
Abstract

In this article, the low volume PCR (LV-PCR) technology and its applications in forensic science were introduced, and the prospect of LV-PCR for solving some difficult problem in forensic science was also discussed.

Keyword: LV-PCR; forensic medicine; application; prospect

在众多的法庭科学实验室中DNA分析技术已经成为一个必不可少的工具。DNA分析技术可以通过对犯罪现场遗留的血迹、精斑、唾液斑、组织、毛发等生物检材的检验来认定和排除嫌疑人。目前常量生物检材的检验已不是问题, 但在实际检案中经常会遇到一些微量疑难生物检材, 如案发现场发现的痕量检材和降解检材, 因此为了适应越来越多的低拷贝检材和降解检材, DNA扩增灵敏度亟待提高。改善方法主要有增加PCR反应循环数、减小反应体积、使用MiniSTR等[1, 2]。通过不断提高灵敏度, 许多微量检材中的DNA都能够检验出来并达到个人识别的目的。其中微量化反应扩增, 即低体系PCR扩增(LV-PCR)已成为提高灵敏度, 加快DNA分析速度经济而有效的方法。

低体系扩增技术主要是指扩增体系低于厂商标准扩增体系的扩增技术, 例如10μ L体系、5μ L体系等, 本文所阐述的低体系扩增技术体系特指1μ L微量扩增体系。

低体系扩增技术是近几年发展起来的新技术, 是一种小容量生物反应体系的技术, 最初主要应用于分子生物学领域的单细胞分型、单细胞测序、与免疫分型和细胞表达和结合。目前国内外[3, 4, 5, 6, 7]已经有学者把这些技术应用于法医DNA检测中。

1 低体系扩增技术简介

低体系扩增技术主要是使用化学修饰的显微玻片, 使PCR反应体积缩小到1μ L。国内外比较通用的低体系扩增体系主要是Ampli Grid System。AmpliGrid 1μ L PCR系统是基于显微镜玻片平面印刷的专利技术, 玻片表面构建多个1μ L亲水性基因座, 使DNA模板、反应混合物(master mix)锚定在此特定位置上, 形成具有最佳半球状结构的反应空间, 疏水性位点使覆盖在反应试剂上的油性封闭液互相隔离, 保证PCR反应过程中无气溶胶产生、无交叉污染; AmpliSpeed热循环仪针对以玻片为载体的PCR反应系统而设计, 采用高平整度的硅晶平面具有极好的热传导性能, 同时1μ L半球状的空间构象, 提供了微量反应最佳的环境, 使灵敏度大大提高[3]。

2 低体系扩增技术在法医学中的应用
2.1 国外研究进展

国外关于低体系扩增技术做了许多研究, 德国科隆大学C.Proff[3]教授和他的团队分别利用SEfiler(28cycles)和PowerPlexES(30 cycles)做了几千个1μ L微量PCR(LV-PCR), 通过对等位基因检出情况的统计分析后, 认为:(1)利用低体系扩增1pg~4pg的模板时, 汇集20~30个平行低体系扩增的结果后再进行后续分析, 可以获得有意义的DNA图谱; (2)单个细胞(约6pg)有21.7%成功分型率, 9个细胞则达到了95.7%的成功率, 其中4个细胞就可以获得完整的图谱; (3)对于常规案例检材用28次平行低体系扩增结果汇集后进行分析, 与常规PCR结果比较, 有显著的提高, 达到55%。Ulrike Schmidt[4]教授以16pg 的9947为模板, 利用低体系扩增技术和PowerPlex16 DNA 扩增试剂盒, 6次结果中有4次成功获得其分型。

2.2 国内研究进展

国内一些学者也对低体系扩增系统做过系统研究, 欧元[5]等人以9947A为模板得出了在同样浓度下, 1μ L系统具有更高的灵敏度; 当模板浓度低于250pg时, 会出现丢峰现象, 但峰高还是在2000左右; 李彩霞[6]等人在单细胞扩增中, 运用显微捕获技术结合低体系扩增技术, 3个口腔上皮细胞平行16次试验均可获得完整分型, 甚至可以低至一个细胞得到完整分型; 黄江平[7]等人利用低体系扩增技术成功进行了混合唾液斑的分型, 使混合微量检材的成功分析变为可能。

3 应用前景探讨
3.1 微量检材检验

对于微量检材来说, 通常的方法是在条件允许下尽可能多的剪取检材, 以便尽量收集微量的DNA, 但这样做的同时导致了体系过大, 影响后续PCR反应, 以至于扩增分型失败[8]; 或者是选择增加循环次数, 但是随之而来的是大量非特异性扩增产物带来的烦恼。利用低体系扩增的高灵敏度, 减少反应体系, 从而为解决微量检材问题提供一种可靠的方法, 对于极其微量的检材还可以选择进行多次平行反应后汇集测序, 以增加微量检材的成功率。

3.2 陈旧降解检材

对于陈旧、降解的疑难检材, 如土壤中的血液, 陈年骨骼等, 通常的方法是进行试剂盒纯化提取, 由于体系过大, 结果往往令人不满意, 因此, 联合应用miniSTR技术, 最大化提高其灵敏度, 是解决陈旧疑难检材检测的很好途径。对于出现大量非特异性扩增的降解检材, 低体系扩增技术可以通过多次重复平行实验来消除非特异扩增出现的机会。

3.3 混合检材

实际检案中, 很多强奸案件检材, 用常规差异裂解法获得的图谱往往是混合图谱或者由于女性成份太多而掩盖男性成份, 很难进行嫌疑人的认定, 极大的降低了检材的利用价值。近年来由于技术的发展, Y-STR新标记的发现, 混合斑的分型及结果的解释出现了一些新的思路, 但结果仍难以满足实际检案的需求, 关于混合斑中男性成份的分离, 法医学工作者进行了许多尝试, 有报道[9, 10]利用激光捕获显微切割技术或者显微镜捕获技术可以只捕获精子细胞, 如果用常规方法对这些“ 好不容易” 得到的细胞进行扩增, 处理效果往往不佳, 而结合低体系扩增技术进行扩增, 可以达到意想不到的效果。

对于一些比较复杂的混合斑, 如两个以上的犯罪嫌疑人共用杯子等物[11], 也可以先进行单个细胞的提取, 再结合低体系扩增技术, 扩增单个细胞, 以解决不同个体的识别, 这对混合检材的检验将实现一个历史性的飞跃。

4 技术展望

目前, 许多实际工作中案件所涉及的现场检材是仅含有微量生物物证的检材, 能否发现并成功地检验出这些检材上的微量物证, 往往对确认罪犯和为案件提供破案线索具有重要意义。目前, 常规方法对微量、超微量生物学检材的STR分型尚较困难, 因为它的分型和标准STR分型有很多不同之处, 主要会出现不平衡扩增、等位基因丢失、Stutter峰增强、非特异性扩增等现象。其中不平衡扩增, 等位基因丢失尤其严重, 经常导致无法正确分型。分析其原因是由于模板量太低, PCR反应存在随机效应所造成。国内外一些学者[12, 13]曾利用全基因组扩增技术试图解决低拷贝问题, 但是微量DNA模板的随机效应阻碍了全基因组扩增的可靠性, 因此很难应用于实际案例中, 还需进一步改善。然而应用低体系扩增技术, 通过减少PCR反应体积, 提高PCR反应灵敏度的方法, 成功解决了低至一个细胞DNA分型的问题, 在国内, 部分研究者[7, 11]结合其他先进技术, 利用低体系扩增技术对模拟检材进行了研究, 取得了满意效果, 这为实际案例中超微量和混合检材的解决提供了依据, 为疑难案例检材的解决指明了方向。

与此同时, 虽然LV-PCR体系在微量检材检验方面表现出了极大优势, 但不能过度夸大LV-PCR技术的作用, 分析其原因, 小体系可以带来更高的灵敏度, 但同时使“ 杂质” 的影响也变相扩大, 进而影响PCR反应。所以, 正确看待低体系扩增技术, 还要同其他先进技术联合应用, 比如说激光捕获显微切割技术[14]、流式细胞仪分离技术等, 才会发挥出更大的作用。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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