甲醇(色谱纯, 天津市四友生物医学技术有限公司); 乙腈(色谱纯, 天津市四友生物医学技术有限公司); 氢氧化钠(化学纯, 沈阳市试剂五厂); 氟乙酸钠标准品(含量大于98%, 公安部物证鉴定中心); BrAP(分析纯, 国药集团化学试剂有限公司); TBABr(含量大于99%, 北京兴福精细化工研究所); 空白血为健康人血; 水为去离子水。

BrAP溶液的配制:乙腈配成0.01mol/L溶液, 冰箱避光贮存; TBABr溶液的配制:去离子水配成10%溶液, 冰箱避光贮存。

FA标准溶液的配制:准确称取10.00mg氟乙酸钠标准品于10mL容量瓶中, 用去离子水定容至刻度。

Finnigan Surveyor液相色谱仪, 配有电喷雾离子源, LXQ线性离子阱质谱仪(美国, Thermo Fisher公司); 80-2型离心机(上海手术机械厂); XW-80A微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器有限公司)。

色谱条件:色谱柱Thermo Gold ODS(150mm× 2.1mm i.d., 5μ m); 柱温30℃; 流动相, 乙腈-水(70:30, v/v); 流速0.20mL/min; 进样体积, 10μ L。

质谱条件:电喷雾离子化源(ESI), 负离子方式检测; 一级质谱全扫描方式检测, 扫描范围50amu~300amu; 二级质谱SRM全扫描方式检测, 母离子194.99, 激发电压 30V, 扫描范围50amu~195amu。

准确量取待测血样0.50mL, 加入0.2mol/L的氢氧化钠溶液0.050mL, 加入0.50mL乙腈, 涡旋混合2min, 5000r/min离心5min, 取上清液50μ L, 加入浓度为0.01mol/L的BrAP溶液150μ L, 加入10%的 TBABr溶液50μ L, 涡旋混合5min, 60℃水浴加热90min, 取适量过0.45μ m有机系滤膜, 滤液供LC-MS测定。

作为饱和脂肪酸盐, FA分子结构式为FCH₂COO^-, 结构简单, 极性较大, 虽然可以利用LC-MS直接分析^[6], 但由于离子特征性差(m/z 77), 无法进行MS/MS检测, 内源性杂质干扰较大, 采用衍生化技术将会极大的改善定性、定量分析性能, 充分发挥LC-MS检测方法的优势。传统的衍生化方法^[9]是在血样中加入适量酸, 将FA转化为氟乙酸, 选用合适的有机溶剂提取、浓缩后, 在无水条件下进行衍生化, 由于氟乙酸具有较强的亲水性和挥发性, 因此传统衍生化方法中, 氟乙酸的提取率较低, 加热浓缩时损失较大。本文在对血样中FA进行衍生化分析时, 血样中加入适量碱后, 直接用乙腈沉淀蛋白, 使分析物完全转移至上清液中, 衍生化在上清液中进行, 所得衍生物直接进行 LC-MS 分析。如果血样中FA浓度较低, 可以取上清液在100℃下浓缩、富集后, 再进行衍生化操作, 由于FA挥发性差, 加热浓缩时损失较小。水相催化衍生化反应原理见图1。

图1

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	图1 水相催化衍生化反应原理

本文采用的衍生化方法中, BrAP作为衍生化试剂, 衍生化后不能被除去, 虽然不会对色谱柱造成危害, 但是衍生化试剂用量越多, 对检测造成干扰的可能性就越大。因此, 本文首先对衍生化试剂的用量进行了考查。实验结果表明, 当BrAP溶液与FA标准溶液体积比为3:1时, 可使衍生物色谱峰面积达到最大值, 而且不随衍生化试剂用量的增加而增大, 因此本文选择BrAP溶液用量为3倍的FA标准溶液体积。

水相催化衍生化反应中, 催化剂是影响衍生化反应程度的重要因素, 本文对催化剂TBABr溶液用量进行了考查, 确定TBABr溶液加入量为BrANP溶液量的1/3。

另外, 本文还对衍生化反应温度、时间等因素进行了详细考查, 选择衍生化反应在60 ℃水浴条件下进行, 反应时间为90 min。

根据衍生化产物FA-AP的结构特征, 本文选择负离子(ESI^-)检测模式, 在负离子扫描方式下对其进行一级质谱分析, 质谱图见图2(a), 基峰离子为其分子离子 (m/z 196.05) 失去一个质子形成的[M-1]^-离子, 丰度大, 特征性强。但是, LC-MS一级质谱背景信号高, 干扰大, 灵敏度低, 而且对于生物检材而言, 由于成分更为复杂, 背景信号将会更高, 导致定性分析准确性和可靠性下降。因此, 本文采用LC-MS/MS方法, 利用二级质谱选择反应监测(SRM)技术, 根据特征母离子的二级质谱特征定性分析FA的衍生物, 大大降低了背景干扰, 提高了检测灵敏度; 同时由于采用二级质谱的SRM检测方式, 子母离子相互配合印证, 避免了一级质谱检测方式的定性专属性差、抗干扰能力不强等缺点。通过解析FA-AP的一级质谱图, 选择基峰离子 m/z 194.99为二级质谱分析母离子, 在此基础上, 进行二级质谱分析, 二级质谱图如图2(b)所示。根据实验结果, 确定二级质谱分析特征离子为m/z 146.96, 然后优化仪器参数使其响应值最大。

图2

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	图2 优化分析条件下血中FA衍生化产物LC-MS分析色谱图和质谱图

本文分别以甲醇、乙腈和水为流动相, 考查了不同条件下FA-AP的分析结果, 最终优选色谱条件为:乙腈-水(70:30, v/v)。图2(c) 所示为最佳分析条件下, FA-AP的LC-MS色谱图, 保留时间(t_R)、二级质谱主要特征离子及其归属见表1。

表1

表1

表1 FA-AP的保留时间(tR)、二级质谱主要特征离子及峰归属 分析物 保留 时间 (min) MS/MS 母离子 主要特征离子 m/z 峰归属 m/z 峰归属 FA-AP 3.34 194.99* [M-H]- 146.96* [(M-H)-HF-CO]- 注:* 为基峰离子和二级质谱定量离子。

表1 FA-AP的保留时间(tR)、二级质谱主要特征离子及峰归属

将分别添加0.15μ g/mL、0.77μ g/mL、1.54μ g/mL、7.70μ g/mL、15.4μ g/mL

5个不同浓度FA血样, 按照“ 1.4样品处理” 操作进行提取、衍生化后, 利用LC-MS/MS进行分析, 以血样中添加的FA浓度对FA-AP二级质谱分析色谱峰面积作曲线, 得到线性方程为:Y=209.80X+0.26, R²=0.9998。由此可知, 采用该方法定量检测血样中FA浓度在0.15μ g/mL~15.40μ g/mL之间具有良好的线性关系。

以信噪比等于3为标准, 测得血样中FA的最低检出限为0.020μ g/mL。

分别取添加0.15μ g/mL、1.54μ g/mL和15.40μ g/mL的FA血样, 按照“ 1.4样品处理” 操作进行提取、衍生化后, 采用LC-MS/MS分析, 每一浓度同一天内提取3次并连续提取测定3天, 分别得到日内精密度平均值为3.43%, 日间精密度平均值为5.31%。

分别取添加0.15μ g/mL、1.54μ g/mL和15.40μ g/mL的FA血样, 按照“ 1.4样品处理” 操作进行提取、衍生化后, 进行LC-MS/MS分析, 每一浓度提取3次, 检测并计算回收率。实验结果表明3个浓度的平均回收率为97.2%。