引用本文
赵兴春, 姜伯玮. 精子细胞定向捕获与分离技术初步研究[J]. 刑事技术,2012,37(1): 14-17
ZHAO Xing-chun, JIANG Bo-wei. Preliminary study on a high specific method for directional capture and separation of sperm cells from forensic samples[J]. Forensic Science and Technology,2012,37(1): 14-17  
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《刑事技术》编辑部
精子细胞定向捕获与分离技术初步研究
赵兴春1, 姜伯玮2
1.公安部物证鉴定中心,北京 100038
2.中国科学院上海应用物理研究所,上海 201800

作者简介:赵兴春(1974—),男,湖南常德人,硕士,副主任法医师。从事NDA检验鉴定与研究工作。E-mail:zhaoxchun@sina.com

摘要

目的 探索并研究精子细胞定向捕获与分离技术,初步建立精子细胞特异性分离与DNA提取的方法与试剂体系。方法 通过特异性定向捕获复合体(精子特异性抗体-磁性纳米微球)的制备,在一定的试剂体系环境下,实现精子细胞的定向捕获与分离。结果 能够实现精子细胞的定向富集与分离,通过后续的提取过程,获得了高质量的DNA,并获得了相应的完整STR分型结果。

关键词: 精子细胞; 定向捕获; 特异性分离; DNA提取; STR
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2012)01-0014-04
Preliminary study on a high specific method for directional capture and separation of sperm cells from forensic samples
ZHAO Xing-chun, JIANG Bo-wei
Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security, Beijing 100038,China
Abstract

Objective To explore the capture and separation technology of sperm cells and to establish a reagent system for sperm cell-specific separation and DNA extraction methods respectively.Methods The sperm samples were prepared with specific capture and separation system and cell were separation from cell mixtures.Results With the help of above complexes, sperm cells were isolated from different mixtures of sperm cells and buccal cells. The specificity of reagent system was additionally checked by DNA genotyping. A complete STR genotyping was obtained by the current reagent system for the capture and separation sperm cells from cell mixtures.

Keyword: sperm cells; capture; specific separation; DNA extraction; STR

法医DNA检测技术已成为现代法庭科学中必不可少的技术手段, 是处置各类案件、重特大事故及自然灾害等重大事件中最有效的个体识别工具[1]。随着DNA扩增与检测手段的不断标准化, 生物检材的DNA提取越显重要, 直接影响检测是否成功以及检测数据获取效率。但当前DNA检验面临生物检材数量庞大、种类繁多、存在环境复杂等问题, 影响实验室工作效率。特别是面对数量庞大的性犯罪案件样本(混合斑等)时[2, 3, 4], 主要以“ 差异裂解法” [5, 6, 7]为主流的混合斑提取技术方法处理样本。但该法存在诸多不足:(1)操作繁琐, 需要进行两步裂解处理, 提取过程涉及大量的离心与洗涤操作; (2)耗时长, 一般需要长时间裂解以充分消化女性成分; (3)费力, 需要操作人员全程跟踪操作; (4)自动化程度低, 整个操作过程涉及诸多离心操作, 无法实现自动化提取。此外, 还存在着分离效率不高, 分离难以标准化等困难, 导致有限的物证材料不能提供足够信息, 迫切需要研制快速、简便、专一、高效而且能够实现自动化提取的相关定向捕获与分离试剂, 进行高效率提取, 获得深层和清晰信息, 为案件侦查和法庭取证服务。

本文研究基于一种精子细胞头部蛋白的特异性抗体的使用, 通过与特定磁珠微球的偶联, 构建一种特异性精子细胞定向捕获复合体, 在优化的试剂体系中实现精子细胞的定向捕获与分离, 达到高效DNA提取与检测目的, 报道如下。

1 材料与方法
1.1 材料及仪器

精子细胞样本由匿名供体提供; 女性口腔上皮细胞样本由匿名供体提供。

蛋白酶K(20mg/mL), DTT(二硫苏糖醇, 1mol/L), QubitTM荧光定量试剂盒, DNATyperTM15 复合扩增试剂盒(公安部物证鉴定中心), PuriTyperTM法医学DNA纯化试剂盒(公安部物证鉴定中心), 羧基修饰磁珠(苏州照康生物科技有限公司), 人精子鱼精蛋白抗体(苏州照康生物科技有限公司), Anti-SPAG8 antibody(Abcam), 其余各种化学试剂均为分析纯。

小型台式离心机(贺利氏公司), 漩涡振荡器(Scientific Industries公司), QubitTM荧光定量仪(invitrogen 公司), ABI 9700热循环仪(Applied Biosystems公司), ABI 3130xl型遗传分析仪(Applied Biosystems公司), 恒温金属浴(德国Eppendorf公司)

1.2 定向捕获复合体的构建

用高浓度的活化试剂(0.05mol/L MES溶液是最常用的试剂, pH6.0)。调整1mL羧基功能化微球(100mg/mL, 固含量为10%)到9.2mL, 终浓度10mg/mL;

用活化试剂清洗1mL微球(100mg/mL)两次, 每次用10mL溶液清洗; 第二次活化后将微球重悬在10mL的活化试剂中, 确保微球被均匀分散。边混匀边加入pH6.0 0.05mol/L MES溶液30mg NHS (N-羟基琥珀酰亚胺, 终浓度3mg/mL)与10mgEDC (水溶性碳化二亚胺, 终浓度1mg/mL); 室温混匀反应60min~120min(18℃~25℃); 使用pH5.0的水清洗两次(离心速度18000r/min, 15min~30min), 最后悬浮在5mL的交联液中, 确保微球分散均匀; 将500μ L 1.0mg/mL抗体1(人精子鱼精蛋白抗体)/抗体2(Anti-SPAG8 antibody)分别溶解在5mL的交联液中(通常是饱和吸附量的1~10倍), 混合微球与蛋白; 室温混合反应2h~4h; 加入猝灭试剂, 终浓度40mmol/L, 混合反应60min; 清洗两次后悬浮在贮存液中; 加入0.01%~0.1%猝灭剂, 0.01%防腐剂, 4℃保存, 即为偶联不同抗体的两种定向捕获复合体(捕获复合体1/捕获复合体2)。

1.3 精子细胞的定向捕获与分离

取适量精子细胞(103~105个); 加入100μ L精子细胞结合液; 加入10μ L的定向捕获复合体; 4℃结合30min, 期间温和震荡;

磁分离, 吸去液相成分, 加入200μ L结合缓冲液, 温和震荡混匀, 进行复合体的洗涤(重复该步骤2~3次), 磁分离去除液相部分。

1.4 DNA提取

采用PuriTyperTM法医学DNA纯化试剂盒进行精子细胞DNA提取。

(1)精子细胞裂解:向含有复合体的EP管中加入190μ L裂解液、10μ L的PK(浓度20mg/mL), 10μ L的DTT(1mol/L), 振荡混匀后56℃孵育, 裂解孵育时间为2h, 期间振荡3次~5次;

(2)羧基磁珠的去除:磁分离, 吸出液相成分, 转移至新1.5mL离心管中;

(3)DNA与磁珠结合:加入600μ L的结合液和10μ L的磁珠常温结合8min(期间振荡3次~5次)。将离心管至于磁架上, 用移液器小心吸去液体, 操作中避免触碰磁珠;

(4)洗涤杂质:加入500μ L的洗液Ⅰ 后涡旋振荡5s~10s, 将离心管至于磁架上, 用移液器小心吸去液体, 尽量避免触碰磁珠; 加入500μ L的洗液Ⅱ 后涡旋振荡5s~10s, 将离心管至于磁架上, 用移液器小心吸去液体, 尽量避免触碰磁珠; 使用洗液Ⅱ 重复洗涤1次, 吸尽液体后室温晾干6min;

(5)洗脱DNA:加入50μ L的洗脱液后涡旋振荡5s~10s, 65℃下孵育8min。将离心管至于磁架上, 迅速将液体吸到另一干净的离心管中, 即可得到DNA;

1.5 DNA定量(QubitTM快速荧光定量)

1.5.1 Quant-iTTMdsDNA HS Assay Kits定量准备 (1)Quant-iTTMWorking Solution的配制:DNA结合染料Quant-iTTMreagent用Quant-iTTMbuffer按照1:200进行稀释即为Quant-iTTMWorking Solution。

1.5.2 标准品的制备 分别取Quant-iTTMstandard1(0ng/μ L)和Quant-iTTM standard2(50ng/μ L)各10μ L与190μ L Quant-iTTMWorking Solution相混合; 用上述标准品按照QubitTM Fluorometer已设定好的程序进行标准曲线的制备。

1.5.3 DNA的定量 2μ L~20μ L的待测样本与180μ L~198μ L Quant-iTTMWorking Solution混合后(样本DNA与Quant-iTTMWorking Solution总体积应为200μ L), 室温静置2min使DNA与染料充分结合, 然后置于Qubit○R Fluorometer中进行荧光检测, 直接从标准曲线上读出与其荧光强度相对应的DNA含量(ng/μ L), 从而计算出移除液相组分的DNA含量。

1.6 扩增及检测

DNA模板量各为1μ L, 采用DNATyperTM15试剂盒进行扩增, 反应总体积为10μ L, 循环数为28。扩增产物用ABI 3130xl遗传分析仪进行毛细管电泳, 以Typer500为内标, 电泳结果用GeneMapper ID v3.2软件分析。

2 结 果
2.1 特异性捕获与分离的可行性

采用不同精子抗体包被捕获复合体与未包被任何精子膜蛋白抗体的羧基磁珠, 在相同精子结合液环境中, 进行单纯的精子细胞样本进行特异性捕获与分离。随后采用PuriTyperTM法医DNA纯化试剂盒直接进行精子细胞的DNA提取纯化, 按照相应操作说明书进行后续PCR及毛细管电泳检测。其DNA定量结果如表1所示, 相对应样本的STR检验结果见图1。

2.2 试剂定向捕获能力

为了进一步探索试剂的特异性捕获与分离的能力, 本研究采用模拟样本即精子细胞与女性口腔上皮细胞混合样本物。采用两种不同精子抗体包被捕获复合体与未包被任何精子膜蛋白抗体的羧基磁珠, 在相同精子结合液环境中, 进行混合样本中精子细胞样的特异性捕获与分离。随后, 采用PuriTyperTM法医DNA纯化试剂盒进行精子细胞的DNA提取纯化, 并依次按照相应的操作说明进行后续PCR及毛细管电泳检测。其检测数据分析结果见图2。试验发现捕获复合体2的分型结果出现了多个位点的RFU值低于50, 见图3。

表1 不同方法所对应的DNA定量结果

图1 精子细胞特异性捕获与分离的可行性研究结果

依上至下分别为空白对照; 捕获复合体1精子细胞STR分型结果; 捕获复合体2精子细胞STR分型结果; 采用PuriTyperTM法医学纯化试剂盒直接裂解法提取STR分型结果。

图2 混合细胞中精子细胞特异性捕获与分离的特异性分析检测结果

依上至下分别为空白对照; 捕获复合体1混合细胞中精子细胞靶向分离后STR分型结果; 捕获复合体2混合细胞中精子细胞靶向分离后STR分型结果; 采用PuriTyperTM法医学纯化试剂盒直接差异裂解法提取STR分型结果。

图3 捕获复合体2分离混合斑中精子细胞所获得的分型结果

3 讨 论

分离生物样本中高质量的DNA片段并去除PCR抑制成分对于法医遗传研究至关重要。在各类性侵害案件中, 精液或精斑作为法医学中重要的生物学检材, 通常伴随着受害者的生物样本成分的存在, “ 差异裂解法” 是解决此类混合检材的主流技术方法。该方法能够在提取过程中有效去除女性成分, 实现男性成分与女性成分的分离, 但全部提取过程涉及诸多复杂操作, 耗时较长、且需要跟踪操作, 无法实现高通量提取, 尤其是在混合斑女性成分较多时难以实现彻底分离。单细胞激光捕获与分离技术是近年来发展起来的一种新技术方法[8, 9, 10, 11], 该方法通过精子细胞形态的特点或特定显微镜下颜色实现其与普通上皮细胞的区分, 然后通过激光显微切割技术实现精子细胞的收集及其与常规上皮细胞的分离, 进而通过微扩增板进行低体系(1μ L~2μ L体系)扩增, 而实现高效率、专一性混合斑中精子细胞的DNA检验。但该法需要依托于大型显微操作平台、低体系扩增平台, 硬件条件要求苛刻; 同时, 对操作人员要求高, 需要具备一定的工作经验和技术水平。

本文的研究目是找到一种简单、高效、特异的分离精子与女性成分混合斑的提取方法, 并考察该方法的可行性, 初步建立相配套的试剂体系, 为该类方法的进一步研究与应用奠定基础。研究基于精子细胞膜蛋白表面抗体, 进行了有关精子细胞特异性捕获与分离技术可行性的初步探索。该方法主要包括以下几个技术难点与关键点:(1)特性抗体的筛选; (2)磁珠捕获复合体的构建; (3)相应试剂体系的建立与优化; (4)相应操作流程的建立。

本研究基于两种不同的精子膜表面蛋白抗体, 通过与羧基功能化磁珠的偶联, 形成了精子细胞特异性捕获复合体。研究过程中首先采用该复合体针对单纯精子细胞进行特异性捕获与分离以检验复合体的有效性。为防止捕获复合体在提取过程中的非特异性吸附导致的假阳性结果, 实验过程中采用未包被任何抗体的羧基功能化磁珠作为对照。精子特异性捕获与分离可行性研究结果表明:(1)所构建的捕获复合体能够与精子特异性结合, 通过后续的DNA纯化步骤能够获得完整的STR分型结果; (2)不同的捕获复合体的捕获效率存在差异, 即复合体1的捕获效率较复合体2高; (3)捕获复合体在结合精子细胞后, 可以省去洗脱步骤, 直接加入含有DTT的裂解液进行裂解, 未见羧基磁珠与DNA之间存在明显的吸附或结合; (4)两种捕获复合体的提取效率均略低于差异裂解法。

针对上述实验现象, 推测可能原因如下:(1)推测与抗原抗体的结合力、结合部位有关, 需进行进一步验证实验; (2)捕获复合体与体系中精子细胞结合后, 现有的体系优化不完全, 使部分精子细胞脱落, 造成DNA损失。

本研究的最终目的是实现混合斑中精子细胞的特异性捕获与分离, 通过模拟混合斑样本的制作, 进一步考察了该技术的应用潜力。首先将女性口腔上皮细胞与精子细胞等比例混合, 采用上述两种不同捕获复合体在已有的结合试剂体系环境条件下, 进行混合斑中精子细胞的捕获与分离。分析比较上述实验结果, 发现以下几种实验现象:(1) STR分型结果中, 各位点RFU值低于单纯精子细胞分离实验所获得STR分型结果的RFU; (2)分型结果未见混有女性成分。推测可能的原因为复合体在与精子细胞结合的过程中, 受到口腔上皮细胞的干扰, 需要对试剂缓冲体系进行进一步优化。同时, 上述实验结果表明, 基于精子细胞特异性捕获复合体进行混合斑中精子细胞成分的分离技术具有可行性。

研究过程中发现, SDS、SLS、TritonX-100等表面活性剂极大的影响捕获复合体与精子细胞的特异性结合(结果未显示), 后续的研究需进一步进行试剂体系的建立与优化工作, 以实现高效的结合与分离。本研究均采用手工操作方法实现精子细胞特异性分离, 后续的研究工作将围绕该方法的自动化应用展开。

本文初步验证了利用磁珠与抗体结合实现精子定向捕获与分离的可行性, 初步建立了捕获试剂体系, 通过与PuriTyper法医学DNA纯化试剂盒的联合应用, 实现了混合斑中精子细胞的特异性捕获与分离, 获得了较为理想的分型结果, 将为后续该类试剂的研制奠定坚实的技术基础。

The authors have declared that no competing interests exist.

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