引用本文
杨电, 张丽萍, 刘超, 徐曲毅. Chelex法和两种磁珠法提取接触DNA效果的比较[J]. 刑事技术,2012,37(1): 11-13
YANG Dian, ZHANG Li-ping, LIU Chao, et al. The comparison of the extraction effects of touch DNA by the Chelex-100 and magnetic beads[J]. Forensic Science and Technology,2012,37(1): 11-13  
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《刑事技术》编辑部
Chelex法和两种磁珠法提取接触DNA效果的比较
杨电1, 张丽萍2, 刘超1, 徐曲毅1
1. 广东省广州市刑事科学技术研究所,510030
2. 广东省广州市公安局白云区分局,510510

作者简介:杨 电(1969— ),女,广东大埔人,副主任法医师,硕士,从事法医DNA检验与研究工作。Tel:020-83118387;E-mail:yangdianyy@163.com

基金: 公安部应用创新计划资助项目(No.2005YYCX57136); 广东省法医遗传学重点实验室建设项目(No.2010A060801001)
摘要

目的 比较Chelex法、DNA IQ磁珠法、EQ国产磁珠法对接触DNA的提取效果。方法 将稀释为10ng、100ng的标准品DNA,分别采用Chelex法、DNA IQ磁珠法、EQ国产磁珠法处理;对30例烟蒂和30例牙刷分别采用Chelex法、DNA IQ磁珠法和EQ国产磁珠法提取DNA,然后进行PCR定量和STR检测。结果 Chelex法对DNA的提取无损失,DNA IQ磁珠法、EQ国产磁珠法对DNA的提取均有不同程度的损失;烟蒂、牙刷等检材采用Chelex法提取的接触DNA量和IPC CT值显著高于IQ磁珠法、EQ国产磁珠法,但STR检验成功率却低于IQ磁珠法、EQ国产磁珠法。2种磁珠法提取的DNA量、IPC CT值和STR检验成功率无显著性差异。结论 污染轻、杂质少的接触DNA检材,用Chelex法提取最为方便快捷;IQ磁珠法、EQ国产磁珠法更适合污染接触DNA检材的提取及自动化操作。

关键词: 法医物证学; 接触DNA; DNA提取; DNA定量; STR分型
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2012)01-0011-03
The comparison of the extraction effects of touch DNA by the Chelex-100 and magnetic beads
YANG Dian, ZHANG Li-ping, LIU Chao, et al
Guangzhou Criminal Science & Technology Institute, Guangzhou 510030, China
Abstract

Objective To compare the extraction effects of touch DNA by Chelex-100, DNA IQ and EQ magnetic beads.Methods The standard DNA diluted to 10ng, 100ng was treated respectively by Chelex-100, DNA IQ system and EQ magnetic beads. DNA was extracted from 30 cigarette butts and 30 toothbrushes respectively by the three methods. The quality and quantity of DNA were detected between PCR quantification and STR analysis.Results There wasn't any loss of DNA with the Chelex method, but with DNA IQ method and the EQ magnetic beads method, some DNA was lost. For cigarette butts and toothbrushes samples, yield of touch DNA and IPC CT extracted by Chelex method are higher than that extracted by DNA IQ method and the EQ magnetic beads method, but they aren't significantly different by DNA IQ method and EQ magnetic beads method.Conclusion The Chelex method is very suitable for extracting DNA from the less pollution and low impurity samples, and the DNA IQ system and the EQ magnetic beads method are more suitable for minute and polluted samples.

Keyword: forensic biological evidence; touch DNA; DNA extraction; DNA quantification; STR typing

目前制约接触DNA检验成功率的瓶颈主要在接触DNA检材的发现和提取上。如何从微量接触检材中提取到足够的DNA以满足法医学检验的需要, 选择合适的提取方法非常关键。本研究同时采用实时定量PCR技术和STR检测分析对Chelex法、DNA IQ磁珠法、EQ国产磁珠法提取的接触DNA的质和量进行系统比较, 为法医工作者如何根据检材、实验室设备等情况选择合适有效的接触DNA提取纯化方法提供科学依据。

1 材料与方法
1.1 材 料

50ng/μ L、5ng/μ L的标准品DNA:用TE液将QuantifilerTM人类DNA定量试剂盒中附带的标准品DNA(200ng/μ L)稀释而成; 实验用的30例烟蒂、牙刷均为2009年本实验室实际案件样品。

1.2 实验方法

1.2.1 Chelex法 对标准品DNA的回收采取在4个离心管中分别加入100μ L 5% Chelex-100, 其中2个管加入2μ L的50ng/μ L的标准品DNA, 另2管加入2μ L的5ng/μ L 的标准品DNA, 然后按文献[1]进行操作。接触检材的提取按文献[1, 2]进行。

1.2.2 DNA IQ磁珠法 对标准品DNA的回收采取在4个离心管中分别加入200μ L制备的裂解液(Lysis:1mol/L DTT为100:1), 其中2管加入2μ L的50ng/μ L的标准品DNA, 另2管加入2μ L的5ng/μ L 的标准品DNA, 混匀。然后将液体吸入到对应的DNA IQ Casework Sample Kit 的试剂筒的1号孔内, 并在试剂筒的7号孔插入一个活塞, 在洗脱管槽中插入一个洗脱管, 管内加入100μ L的洗脱液。然后把试剂筒移到MaxwellTM16 自动仪的平台上进行自动化磁珠提取。接触检材的提取按文献[3]在MaxwellTM16 自动仪上进行。

1.2.3 EQ国产磁珠法 对标准品DNA的回收:在4个离心管中分别加入200μ L制备的裂解液(Lysis:1mol/L DTT为100:1), 其中2管加入2μ L的50ng/μ L的标准品DNA, 另2管加入2μ L的5ng/μ L 的标准品DNA, 混匀。开盖置于Bio-Robert Universal System自动化工作站配套的样品架上进行自动化提取程序[4]。接触检材的提取按文献[4]进行。

1.3 DNA定量、扩增和统计学处理

按Quantifiler法医人类DNA定量试剂盒(购自美国AB公司)使用手册在ABI7500 型荧光定量PCR仪上进行定量PCR 反应。荧光标记STR复合扩增用SinofilerTM Kit(美国AB公司)进行, 扩增体系为8μ L。在AB 3130xl遗传分析仪上进行毛细管电泳检测分型, 以获得性别及9个以上STR基因座的明确分型为成功, 并分析扩增效果。

数据处理用SPSS13.0软件, 方法比较采用重复测量数据的方差分析, 检验水准α =0.05。

2 结 果
2.1 3种提取方法对标准品DNA的回收效率比较

将10ng、100ng的标准品DNA各2份, 分别采用Chelex法、DNA IQ磁珠法、EQ国产磁珠法处理后, 标准品DNA的回收结果见图1。可见, Chelex法对DNA的提取无损失, DNA IQ磁珠法、EQ国产磁珠法对DNA的提取均有不同程度的损失, DNA IQ磁珠法对DNA的回收率略高于EQ国产磁珠法。

图1 3种提取方法对标准品DNA的回收率(%)

2.2 Chelex法与IQ磁珠法、EQ国产磁珠法提取接触DNA的比较

30枚烟蒂、30把牙刷取同样大小的各3份, 分别用Chelex法、DNA IQ磁珠法和EQ国产磁珠法提取DNA。3种方法提取的DNA含量和IPC CT值见表1、2。烟蒂、牙刷采用Chelex法提取的DNA平均含量显著高于IQ磁珠法、EQ国产磁珠法(P=0.036< 0.05), IQ磁珠法提取的平均DNA量虽然比EQ国产磁珠法略高, 但统计学比较无显著性差异(P=0.086> 0.05)。Chelex法提取的烟蒂、牙刷的DNA IPC CT值也比IQ磁珠法、EQ国产磁珠法高(P=0.021< 0.05), 但IQ磁珠法、EQ国产磁珠法的DNA样品的IPC CT值之间无统计学差异(P=0.558> 0.05)。

表1 3种方法提取的接触DNA量的比较( x¯± s, ng)
表2 3种方法提取的接触DNA IPC CT值的比较( x¯± s)

Chelex法提取的DNA含量虽然比IQ磁珠法、EQ国产磁珠法高, 但STR检验效果却不如后两者(见图2)。特别是陈旧检材DNA用Chelex法提取时, 容易出现等位基因扩增不平衡、甚至小片段优势扩增导致大片段等位基因缺失现象。而IQ磁珠法、EQ国产磁珠法提取的DNA扩增不平衡现象不明显, 峰高均衡。图3 A、B、C为1例放置3个月的牙刷分别采用Chelex法、IQ磁珠法、EQ国产磁珠法提取的接触DNA的STR图谱(均为2μ L扩增Sinofiler系统)。Chelex法提取的牙刷DNA虽然浓度为1.05ng/μ L, IPC CT值为27.86, 扩增Sinofiler系统的STR图谱CSF1PO、D2S1338、D18S51基因座出现等位基因峰值过低甚至缺失现象, 而IQ磁珠法、EQ国产磁珠法提取的牙刷DNA的STR图谱峰高均衡, 分型完整。

图2 3种方法提取的接触DNA STR检验成功

图3 1例放置3个月的牙刷分别采用3种方法提取

3 讨 论

Chelex法提取DNA, 操作简单快速, 整个提取过程均在一个离心管中进行, 避免了DNA在提取过程中的损耗和二次污染, 对标准品DNA的回收率达到100%。因此污染轻、杂质少的接触DNA检材, 用Chelex法提取最为方便快捷。但Chelex法不能去除DNA溶液中的杂质和降解的DNA碎片。虽然Chelex-100提取DNA前采用洗涤的方法能去除一些PCR抑制物, 但反映扩增抑制物多少的IPC CT值显著高于IQ磁珠法和EQ磁珠法。因此Chelex法提取的DNA进行STR扩增时, 即使模板量在试剂盒推荐的范围内, 也容易出现等位基因扩增不平衡、甚至小片段优势扩增导致大片段等位基因缺失的现象。

磁珠法利用细胞裂解液裂解细胞, 从细胞中游离出来的DNA分子被吸附到磁性颗粒表面, 蛋白质等分子不被吸附而留在溶液中。在磁场作用下, 磁性颗粒与液体分开, 回收颗粒, 再用纯水或TE洗脱吸附的DNA。磁珠法与Chelex法相比, 能有效去除100bp以下的DNA小片段和样品中的色素、蛋白质等杂质, 并可通过调整洗脱液的量对DNA进行浓缩, 获得的DNA样品纯度高, 因此STR扩增时峰高比较均衡, 小片段优势扩增现象不明显。以往认为, 磁珠法不需要离心, 而且在同一个反应管内提取, 没有样品的损失。但最近的文献提出磁珠法提取对DNA有一定的损失[5, 6] 。本研究也证实, 磁珠法在提取过程中存在有DNA的损耗, 不过通过调整洗脱液的体积, 仍能获得较高的DNA浓度, 因此, 更适合微量、污染检材的DNA提取及自动化操作。

IQ磁珠法与EQ国产磁珠法相比, 虽然提取的平均接触DNA量要高一些, 但统计学比较无显著性差异。同时EQ国产磁珠法不仅价格更便宜, 还少了1个裂解液洗涤和1个洗涤液洗涤的步骤, 操作更为简单, 因此完全可以用EQ国产磁珠替代IQ磁珠提取接触DNA。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 杨电, 刘超, 徐曲毅, 等. Chelex-100法提取脱落细胞检材DNA的实时定量研究[J]. 刑事技术, 2009(5): 30-31. [本文引用:2]
[2] 杨电, 刘超, 徐曲毅, 等. 微量口腔脱落细胞检材的DNA检验[J]. 法医学杂志, 2008, 24(2): 126-128. [本文引用:1]
[3] 杨电, 刘超, 徐曲毅, 等. DNA IQ磁珠法结合Maxwell 16自动仪提取接触DNA进行STR检验[J]. 刑事技术, 2011(3): 3-5. [本文引用:1]
[4] 杨电, 刘宏, 刘超, 等. 国产磁珠结合自动化工作站批量提取生物检材DNA的应用[J]. 中国法医学杂志, 2009, 24(6): 404-406. [本文引用:2]
[5] Nagy M, Otremba P, Krüger C, et al. Optimization and validation of a fully automated silica-coated magnetic beads purification technology in forensics [J]. Forensic Sci Int, 2005, 152: 13-22. [本文引用:1]
[6] Ram Kishore, W. Reef Hardy, Vince J, Anderson , et al. Optimization of DNA extraction from low-yield and degraded samples using the BioRobot EZ1 and BioRobot M48[J]. J Forensic Sci , 2006, 51(5): 1055-1061. [本文引用:1]